聚合酶链反应及基因突变检测方法培训课件.pptVIP

6、其它反应因素 pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =7.2左右） 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交 基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性） 精品 （二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量） 精品 1、温度 变性温度：94 ~ 97 ℃ 退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右 温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶 促活性 精品 2、时间 第一次变性应给予足够时间（5 ~ 7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~ 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增 精品 3、循环次数 重复次数一般设为25～35个循环 扩增反应的平台效应： 理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长 精品 指数增长期 线形增长期 平台期 循环数 # 理论值 实际值 Log 产物DNA PCR过程的实时监测 精品 平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。 平台效应产生的因素： 引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等 精品 三、PCR技术的质量控制 （一）实验室的规范化设置 实验室的规范化设置： 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 PCR技术的质量保证： 基因扩增检验的全过程的质量保证 室内质量控制和室间质量评价 PCR实验系统中的污染源及防污染措施 精品 防污染体系： 正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量 精品 （二）PCR技术的质量保证 分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存 分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置 对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等） 分析后因素：报告形式、反馈的信息等 精品 第二节 以PCR为基础的相关技术 精品 以PCR为基础的相关技术 逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 定量PCR (quantitative PCR ) 多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR 差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR) PCR诱导定点突变 原位PCR (in situ PCR) 精品 一、逆转录PCR（RT-PCR） 以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等 精品 逆转录生成cDNA方式： 以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物 以oligo(dT)作为引物， mRNA3`末端polyA尾与之互补 以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增 精品 精品 二、定量PCR 对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。 主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等 在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。 内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是?-肌球蛋白基因 精品 绝对定量 PCR 外参照系统的设置 内参照系统的设置 实时定量 PCR 对核酸扩增反应进行直接和动态的监测， 实现对靶基因的实时定量分析 精品 荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法 FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量 精品 荧光信号的检测方法： 1、DNA结合染料技术 2、水解探针技术（TaqMan probe）技术 3、杂交探针技术 精品 精品 精品 精品 TaqManTM 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Thermal Stable DNA Polymerase Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’