鲤春病毒血症病毒（SVCV）糖蛋白基因分析、改造及其克隆与表达-临床兽医学专业论文.docx

鲤春病毒血症病毒(svcv)糖蛋白基因分析、改造及其克隆与表达鲤春病毒血症病毒(sVCⅥ糖蛋白基因分析、改造及其克隆与 鲤春病毒血症病毒(svcv)糖蛋白基因分析、改造及其克隆与表达 鲤春病毒血症病毒(sVCⅥ糖蛋白基因分析、改造及其克隆与 表达 摘要 鲤春病毒血症病毒(s研ng Viremia of Carp Virus，简称svcv)是一种能够引起鲤 科鱼类急性传染病的病原，一旦暴发会造成巨大的经济损失。SVCV是一种弹状病 毒，囊膜来自宿主细胞，很难制备高效价的抗血清。研究发现。SVCV糖蛋白(G)由 509个氨基酸组成，是典型的跨膜糖蛋白，它形成三聚体的长钉状，位于病毒表 面，与细胞上的受体结合介导病毒的内吞作用，是决定病毒血清学特征的主要抗 原。因此深入研究SVCV糖蛋白对于疾病的检测和诊断，以及疫苗的研制开发都将 具有重要的意义。 本文利用生物信息学的方法对8个国内分离株糖蛋白基因的550 bp序列与 Genbank中的相关序列进行比对，绘制SVCV部分糖蛋白基因序列的系统发育树， 以期了解不同地域分离株糖蛋白序列的变异性以及它们之间的关系。同时利用 Omiga软件对国内分离株和欧洲株糖蛋白基因推导出的氨基酸序列进行初步分析， 发现它们均存在下述6个功能位点，分别为ASN．GLYCOSYLATION位点、RGD 位点、CK2-PHOSPHO位点、PKC—PHOSPHO位点、TYR—PHOSPHO位点和 MYRISTYL位点。对于这些功能位点在病毒侵染细胞和细胞凋亡中所起到的作用和 机制，有必要做进一步的研究。同时，对于8株糖蛋白的抗原性、亲疏水性及跨膜 区也做了比较分析。 本研究根据GenBank上接受号为NC一002803序列中糖蛋白基因为模板，设计 引物，去除糖蛋白基因开放阅读框前端的信号肽序列，以利于目的基因的正确表 达。以cDNA的克隆载体为模板，扩增得到目的基因片段SSS517(欧洲株糖蛋白序 列)和SSS521(亚洲株糖蛋白序列)，双酶切分别克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZgA 和pGAPZaB中，转化大肠杆菌，获得重组表达质粒pGAPZaA．517和DGAPZaB一 521，BlnI单酶切线性化，电击法转化毕赤酵母SMDl 168，Zcocin抗性筛选重组酵 母转化子，用酵母菌落PCR法鉴定重组菌落。取其中阳性酵母菌小量发酵培养，将 浓缩得上清蛋白和裂解得酵母细胞总蛋白进行SDS—PAGE，转印，western—blot检 测，未检测到目的蛋白。根据毕赤酵母密码子的偏爱性，同时综合考虑真核系统中 5 鲤春病毒血症病毒(sVcv)糖蛋白基因分析、改造及其克隆与表达影响转录、翻译及mR．NA稳定性等因素，对国内分离得到的741菌株在不改变其编 鲤春病毒血症病毒(sVcv)糖蛋白基因分析、改造及其克隆与表达 影响转录、翻译及mR．NA稳定性等因素，对国内分离得到的741菌株在不改变其编 码氨基酸序列的基础上进行基因优化改造，并设计合成了该基因全序列。将合成的 基因克隆到毕赤酵母表达载体pGAPznA上，构建重组表达质粒pGAPZnA-7419p— newo 本文构建了SVCV糖蛋白基鼠的系统发育树，确定了国内分离株的来源以及与 欧洲株和美国分离株在进化上的关系。对推导出的糖蛋白氨基酸序列进行了初步的 功能位点分析和抗原性分析等，为进一步深入研究SVCV致病机理，有效切断 SVCV的传播途径打下基础。本研究构建了一株欧洲株和两株国内分离株糖蛋白基 因的分泌型表达质粒，并将其转入毕赤酵母进行初步表达分析，以探索毕赤酵母表 达SVCV糖蛋白的可行性。截至目前，SVCV糖蛋白在毕赤酵母中的表达还未见报 道，而且本研究首次提出将糖蛋白基因序列进行优化改造，为其在毕赤酵母中的大 量表达奠定了基础。因此本研究在理论方面和应用方面都具有重要的意义。 关键词i鲤春病毒血症病毒；糖蛋白；生物信息学分析；巴斯德毕赤酵母；表 达 6 塑壹堕童皇壅塑童!!!翌!堕墨鱼茎里坌堑：堕堕墨茎塞堕量墨堕Bioinformatic 塑壹堕童皇壅塑童!!!翌!堕墨鱼茎里坌堑：堕堕墨茎塞堕量墨堕 Bioinformatic analysis，modification，cloning，and expression of the glycoprotein gene of spring viremia of carp virus(svcv) Abstract Spring viremia of carp virus(svcv)is serious pathogen which causes all acute contagious viral disease of Cyprinidae with important economic impact．SV