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分子生物学研究法 分子生物学技术体系 一. 基本技术 二. 基因(狭义)及产物 分子检测技术 三. 基因(狭义)及产物 获取技术 四. 基因 (广义) 功能研究技术 一. 基本技术 1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS电泳 PCR技术 细菌转化 1.琼脂糖凝胶电泳 1、原理： 2、用途： 琼脂糖凝胶电泳的原理 1. DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益 （1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构型； ( 3) 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比； （分子量越大，跑得越慢） 2、检测原理： （1）溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中，在紫外光照射下，发射荧光。 琼脂糖凝胶电泳用途 1. DNA分子量测定（距离－分子量） 2. 基因，克隆的鉴定（通过1完成） 3、不同长度的基因片断的分离 4、DNA浓度的测定 （荧光的强度与DNA含量成正比） 加标准分子量DNA Marker,测定分子量 加标准浓度的DNA，测定浓度 2. SDS电泳 1、原理 2、用途 SDS电泳原理 1.SDS(带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构, 同时SDS与蛋白定量结合, 消除蛋白之间的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依赖分子量 (分子小跑得快) . 2.不连续电泳: 上层为浓缩胶,可将样品压缩到同一起跑线, 下层为分离胶; 可获得更高的分辨率. 3.考马斯亮蓝进行染色. SDS电泳用途 1.蛋白分子量的测定 2.蛋白浓度的测定 3.蛋白的鉴定(通过1来实现) 3. PCR(聚合酶链式反应) 技术 4. 细菌转化 通常情况下，外源基因无法进入细菌细胞内； 当用电击法，或CaCl2，或RuCl等方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源基因进入的感受态细胞。 感受态细胞的活性较低，处理需温柔。 二. 基因(狭义)及产物 分子检测技术 定性, 定量, 定位 1. DNA (分子量和序列 ) (1)(酶切)电泳; (2) PCR; (3)Southern blot; (4) 染色体原位杂交 (5)测序; 2. RNA (序列) (1)RT-PCR (2) Northern blot (3) RNA原位杂交 (4) DNA芯片技术 ; (5)基因表达系列分析技术（SAGE) 3. 蛋白(分子量, 结合特性, 酶学特性) (1)SDS; (2)质谱技术; (3)Western blot; (4) ELISA; (5)蛋白芯片技术; (6)免疫组化 (7) EMSA; (8)免疫共沉淀技术 CoIP; (9)蛋白质磷酸化分析 Southern blot Southern blot 原位杂交技术 通过标记的核酸探针, 在组织,细胞,间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段. (1) RNA原位杂交组织切片中,该基因的表达产物(mRNA)在细胞水平上作出定性定量分析.-?{区别 免疫组化(蛋白)} (2) 染色体原位杂交eg. 荧光原位杂交(FISH), 确定DNA序列染色体上的位置. 双脱氧法测序(Dudeoxy sequence analyses) Northern blot 生物芯片技术 生物芯片是八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固格体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。 主要特点 高通量、微型化和自动化。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。但目前的成本较高，重复性较差。 生物芯片分类 (1) 用途 1 . 样品制备芯片 2. 生化反应芯片（如PCR芯片） 3. 检测芯片 （如基因芯片，蛋白芯片） 4. 芯片实验室 （是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统）。 生物芯片分类 (2) 制造技术 基因表达系列分析技术（SAGE) 以测序为基础的定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息； 理论依据：９－１０碱基的核酸片段可代表一种转录产物的特异序列（序列标签） 某序列标签占总标签数的比例对应编码基因的表达频率． MS质谱技术 质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比(m/z)的差异来分析蛋白质和多肽