利用cDNA捕捉法和抑制差减杂交方法克隆小麦抗病基因相关片段-细胞生物学专业论文.docxVIP

摘要小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒引起的小麦严重病害之一。小麦中缺乏良好的抗 摘要 小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒引起的小麦严重病害之一。小麦中缺乏良好的抗 源。中国农业科学院作物科学研究所综合利用生物技术选育了抗黄矮病小麦．中间偃 麦草易位系Yw642，研究表明从中间偃麦草获得的抗黄矮病基因为显性单基因，该 基因被命名为曰d佗。克隆抗黄矮病基因对研究植物抗病分子机制和培育抗病品种有 着非常重要的作用。本研究尝试利用cDNA捕捉法、抑制差减杂交方法以及筛选抗 黄矮病小麦．中问偃麦草易位系Yw642可转化人工染色体(11Ac)基因组文库分离、 克降小麦外源抗黄矮病桀冈相关片段。 利用集群内删除方法，从抗黄矮病小麦易位系Yw642噬菌体cDNA文库中制 备了质粒cDNA文库，从质粒cDNA文库中制备了总单链质粒DNA。根据抗病基因 NBS保守结构域设计寡核苷酸探针，利用Gcnetrapper固cDNA Posistive Selection system(Invitrogen。M)筛选抗黄矮病小麦易位系cDNA文库，对文库中含有抗病基因 保守结构域的cDNA克隆进行富集，得到3 000个单克隆。以P1、P2为引物通过菌 落PcR鉴定阳性克隆，从450个单克隆中筛到3个阳性单克隆。提交GenBalll(进行 B】ast序列比对，结果表明：克隆4一l与面包小麦的泛素cDNA同源性很高，克隆4—2 与豌豆异戊酰辅酶A脱氢酶基因mRNA具有较高的同源性，克隆5—3与Rubisco cDNA高度同源。 以Yw642／中8601的F2代纯合的抗病和感病单株各10株提取DNA构建成近 等基因池，以抗病池为试验方，以感病池为驱动方，进行抑制差减杂交(ssH)，构建 差减文库，文库包含960个克隆，插入片断100bp～1200bp，平均插入片断为350bp。 利用正向抑制差减杂交和反向抑制差减杂交的产物为探针进行差异筛选排除假阳 性，从192个克隆中得到8个阳性克隆，阳性率为4．2％。经southem杂交验证，其中 克隆TsH．1具有抗病池特异性，且为寡拷贝或单拷贝序列。经测序，TsH．1长388bp， 提交GenBank进行Blast比对，没有找到与之同源的序列，说明TsH．1为新的序列。 以与Bd伦基因共分离的scAR标记sc．gpl为探针利用克隆池PcR法筛选抗 黄矮病小麦．中间偃麦草易位系Yw642可转化人工染色体(C)基因组文库，从 1440个初级克隆池中筛到一个阳性克隆池2G4，进一步筛选到次级克隆池2G4．6和 次次级克隆池2G4．6．52、2G4．6．53为可能的阳性克隆池。为进一步筛选阳性单克隆 奠定了基础。 关键词：小麦，黄矮病，抗病基因，抗病基因保守结构域，抑制差减杂交，cDNA 捕获，可转化人工染色体基因组文库 Abstractwheat Abstract wheat yellow dwarf(wYD)caused by barley yellow dwarf Vifus(BYDV)is wheat disease．The distal segment of the long arm of the Z砸加哪叫r册z拥耙硎础“m c11romosome 7』钻1(7x)carries BYDV resistance gene曰d佗．This scgment was transferred the djstal region of the 10ng盯m of wheat c量lromosome 7D in Ihe YW642 of translocation lines by using the脚j6 mut induce homoeologous pairing．It js found thaI Ihe rcsistancc gcnc丹d伦t’rom 71^m唧叫，“州胁把，me讲“m is dominant sin91e gene．Cloning of the resistance gene BYDV is Very important f3r elucjdating resistance mechanism and breeding resistant cunivaL In tIlis research，cDNA c印ture，suppression subtractjVe hybridization(ssH)and s‘=reening of transformation—competem anificial chromosome genome library of wheat·力l加哪矽r“珑 拥七朋qe出“m 1Yanslocation liIle YW642 were carrjed c】one candidates