立碗藓原生质体分离及培养的研究;烟草中RNAi体系的研究-生物学 植物学专业论文.docxVIP

勋型型型型塑 勋型型型型塑 墼 摘要 第一部分：立辘藓最巍质体分离文培养的研究 {基因打靶技术通过利用同源麓组可班在一定獠度上实现外源然因的定向整合；同 时、还可通过对某赫因的剔除研究簸因的功能或通过创造定点突变来研究浆种代谢机 蘧。 但基因打靶技术目前主要应用于细菌，酵母和一些丝状真菌，在高等植物中应用 极少。舔阂是裔等宾核垒纺孛丽潦重组静发生频率稷低。小立碗懿是最遥被开发浓来 的用于研究基因打靶的模式植物，其基因打靶的效率可以与酵母相比。，，j。’ 本论文采溺生长纛蔻家缝嚣豹麓夸立蕊藓同辩立硫棼(Physcomitrium sphaericum)为材料，探讨其无菌培养的条件。由于藓类植物特殊的生物举结构用农 、抒菌馒梁蔟涿丝体载者茎许俸缀难实骚转纯，戳黎生霞体律受俸楚藓类禳物转纯豹常 用途径。爿秧验摸索得到了影响立碗藓原生质体产量及活力的几项因素。为藓类植物 蘩逼努赣瓣磷究葵定了一定煞基继。 f通过对立碗藓的无菌培养和原生质体操作发现； (1≥立凌獒憨麓接静奁无蘩MS、Benecke、Knop壤葬蒸上，均鼙藐发产生寡丝俸， 但不久便分化为蔓叶体，很难长期保持其原丝体状态，不问培养基条件下原丝 锩状态骞酝不同。 (2)通过不同浓度的激素组合诱导愈伤组织研究发现：当采用6-BA 0．5 me．／1， 2菇-D 0．5獭薛时，立魂瑟蔽丝体土长出薅蚣暴碎戆鑫绿色蠡伤缝织。 (3)采用不同阶段的原丝体和蒸叶体进行原生质体的游离发现：15．17天的原丝体 爱分离嚣篷矮俸戆最佳毒葶瓣，超过三周豹派丝俸瓣解褥裂匏原叟质体数鬃穰 少，茎叶体分离原生质体踅难。 (．幸)逶过对原熬体预勉理不同瓣润鼹察表明酶孵翦髑0．02％Tween-80预处璞30 rain能明显提高原生质体的产量。 (5)采用不同浓度和耪类的酶来游离原生质体效果不同，其中，O．5％纤维豢酶 +O．4％果胶酶+o．5％离析酶+O．3％半纤维素酶对0．19的原丝体进行2小时的酶 麟戆够得到5×103个／ml愿生质体，原生鼹体保持较高酶活力。＼一． 7) 关键词：立碗藓原尘腰体基阂打靶 一一一——一 ， 首都师范犬学硕士学位论文 首都师范犬学硕士学位论文 摘要 鼻已二部分：烟草中RNAi体系的研竞 f随着人类基因组测序工作的完成，基因组研究已经由以全基因组测序为目标的结 构基因组学转向以基因功能鉴定为目标的功能基因组学研究。近几年发展起来的 RNAi技术，能快速有效的关闭相应基因，使生物体产生相应的功能缺陷表型，从而 确定未知基因的功能。其以特异性、高效性和广泛性的优势，已经逐渐成为一项极具 潜力的基因功能研究技术。 本研究通过将GFP(绿色荧光蛋白)表达盒连接在pBINl9载体上，首先得到了 含GFP的表达载体；然后将此载体通过农杆菌介导法转化野生烟草的叶盘，经过1．5 分钟侵染，共培养2-4天后，在含Kml00 mg，l，Carb 500mg／l的培养基上进行抗性筛 选，不定芽长到1 cm左右时，转移到生根培养基上进行生根培养，最终得到了32 株抗性植株；对抗性植株进一步的分子检测发现：其中26株表现为PCR、PCR-Southcm 阳性，证实了GFP基因确实已整合到烟草基因组中；另对转化体提总RNA进行 RT-PCR鉴定，发现有22株检测到GFP基因的相应条带，证明GFP基因已在部分烟 草体内转录为mRNA；但用荧光显微镜体外检测转基因烟草的气孔保卫细胞，未发 、√d，一1 现绿色荧光。41厂 {1本研究旨在利用GFP基因在烟草中建立一套RNAi的体系，即在得到的含GFP 的转化体中导入含部分GFP基因的dsRNA载体，通过观察GFP的表达情况来分析 RNAi现象在烟草中的发生情况及发生程度，为在烟草中利用RNAi技术进一步研究 基因功能打下良好的基础。 载体的构建工作已经将部分正义GFP序列插到载体上，构建得到 (pCAMBLA 3301+single PCR fragment)，其他后续工作还在进行 之中。＼一一∥一 关键词：RNAi dsRNA GFP塑芋璁堂茎里塑学 II 黧型逛幽墼～ 黧型逛幽墼～ 塑塑 Abstract Isolation and Culture of Protoplasts of Physcomitrium sphaericum Gene targeting by homologous recombination call realized targeted integration．At the same time We can knock-out some gene to know its genetic function and create specific muta