利用毕赤酵母发酵表达植物甜蛋白(Brazzein)的初步研究-生物化工专业论文.docxVIP

北京化工大学学位论文原创性声明 北京化工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的 指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明 引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：赵缸铃 2004年5月20日 北京化工大学硕+论文利用毕赤酵母发酵表达植物甜蛋白(Brazzein)的初步研究 北京化工大学硕+论文 利用毕赤酵母发酵表达植物甜蛋白(Brazzein)的初步研究 中文摘要 近年来从非洲植物中提取出了一些甜味蛋白，作为一种天然非糖 类的甜味剂，其具有高甜味、低热卡、无毒安全、多功能等优点，不会 导致龋齿和肥胖症，糖尿病患者也可以食用。但是由于提取资源有限， 利用基因工程的方法生产甜味蛋白，具有重要的现实意义。 本文研究的植物甜蛋白(Brazzein)是甜味蛋白中分子量较小的一 员，仅为6．4kD，由54个氨基酸残基组成，它的相对甜度是蔗糖的2000 倍，而且具有良好的热稳定性。已有人成功的利用大肠杆菌和转基因 植物实现了表达。毕赤酵母是一种可以以甲醇为唯一碳源的非常规酵 母，具有强有力的AOX启动子，可将外源基因整合到宿主的染色体上， 继代十分稳定，蛋白可以分泌表达，实现高密度发酵，因此毕赤酵母 是一种高效蛋白表达体系。本文采用巴斯德毕赤酵母(Pichiapastori) GSll5作为宿主菌进行了表达植物甜蛋白(Brazzein)的初步研究。 将含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭质粒电导入巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastori)GSll5中，并从22个His+Mut5阳性克隆中筛选出高拷 贝转化子2个，将其诱导分泌表达的产物进行Tricine—SDS．PAGE电泳 鉴定，目标蛋白分子量与理论值一致；对发酵条件进行了优化，采用 YPG作为种子液，确定了微量元素加入量为4ml／L，6％(w／v)的甘 油，(NH4)2S04 109／L的培养基新配比，在28。C、pH5．0下培养，每 24h加入0．5％(v／v)的甲醇进行诱导为最佳。该条件用于指导小试 (5L／10L罐)，蛋白表达量达到了385mg／L；采用等电沉淀、大孔树脂、 北京化工大学硕士论文凝胶层析和几种阴、阳离子交换柱的方法对发酵液进行了初步分离研 北京化工大学硕士论文 凝胶层析和几种阴、阳离子交换柱的方法对发酵液进行了初步分离研 究。强阳离子交换层析SP Sepharose FF用含有0．4MNaCI的20mmol／L、 pH4．1 NaAC．HAC缓冲体系洗脱可得到有微甜味的产物，对产物采用 Tricine—SDS—PAGE电泳鉴定分予量一致，采用600．MHzIH NMR核磁 共振，与文献报道大肠杆菌表达的重组甜蛋白600-MHztH NMR核磁 共振谱图比较，主要官能团的化学位移基本一致，该结果进一步证实 植物甜蛋白Brazzein在毕赤酵母中也得到了正确表达。 关键词：Brazzein，巴斯德毕赤酵母，基因重组，分泌表达，分离纯化。 北京化工大学硕上论文BRAZZEIN 北京化工大学硕上论文 BRAZZEIN EXPRESSl0N IN METHYLOTROPHIC YEAST PICHlA l後sToRIs ABSTRACT “Brazzein”，a 54一amino—acid sweet—tasting protein，is thermostable and relatively persistent taste．Brazzein is frrstly isolated from the fruit of Pentadiplandra brazzeana Baillon found in West Africa．The methylotrophic yeast Pichia pastoris is a developing system for high level expressing heterologous proteins in recent years，taking methanol as the unique carbon source． The plasmid pPIC9K was chosen as vector to construct expressing plasmid pPIC9K／Bi，which was linearized by restriction endonuclease BgllI and transformed into the yeast Pichia pastoris GSl 15 by elect