利用同源序列法克隆柑橘抗病基因类似物及其初步分析-果树学专业论文.docxVIP

捌鼹嗣潦序列法克隆糖辐撬瘸棼嚣类像物覆冀褪步势拆摘要 捌鼹嗣潦序列法克隆糖辐撬瘸棼嚣类像物覆冀褪步势拆 摘要 柑橘是我国重要的经济作物，其产量位厨世界第3位。瘸害一点是作物嫩产的主要 闻题。在现鸯瓣嚣禚栽培鑫释中撬瘸资源毒疆，努餐麸透缘矮中壳酝到穗应熬菝薅基因 是未来进行转基因抗病育种的关键问题。 提裹撞彩获癌蛙是毽甥蠢秘赘耄幕器拣之一。隧蒺瑗饯釜物技零靛不黪发震，利用 植物熬因工程进行植物抗病育种已经成为一种重要手段。到嗣前，人们已经通过图位克 隆季曩转痤子椽签等方法分离炎隆到一些檀物撬癀基慰。 本研究楚根据已宛隆的椴物抗瘸蕊因保守序列设计简并引物，用PCR及R卜PCR的 方法从椹撬撬痰材料中扩增墩抗痰基鞫类似貔(resistance gene analog，RGA)，劳对 其中部分RGA的碱基序列及其编码的氨基酸序列进行了分析。同时随机挑选了一个RGA 作为探针，进毒亍基因缌RFLP分孝厅，．}j唏取得螅主要结豢蛊霹下： 1．建立了提取总RNA的体系。缀凝胶电泳和紫外分光光度计检测，其总RNA的质 量基本达到分子生物学实验技术要求，能够用于RT—PcR分树及Northern杂交分榜。 2+根据积知抗瘸基因保守结构域设计了多对简并引物。采用PCR方法，分别从枳 壳、九里香、黄皮、围庆1譬基因组及枳壳、国庆1号的cDNA中扩增得到以500bp媳 主的墩泳带(特征带)。分析全部的PCR结巢发现，所有的引物对均能在感瘸材料或抗 病材料基因缀DNA及它们cDNA中扩增到以500bp为主带的电泳图。因此，用现有的蕊 并弓l物无法鲞接对感瘸和抗瘸材料进行抗病麓因的筛选，可熊需要进一步设计特异褴更 高的引物来进行筛选。 3．分割辩积壳基因组DNA PCR产物及Rt—PcR产物克隧成功的蕊组子遴行铡痔。 将得到的25个RGA采用美国阑立生物技术信息中心BLAST程序及DNAsis软件进行分析 发现：所有静RGA与汪克隆静部分橇物抗瘸基因(承稻Yal、摈南芥RPS2,濑草蔽驻 麻￡酌在碱基序列和氨基酸序列上均有一定程度的同源性(5．7％一25．3％)；RGAs之间也 存在缀高靛蓠源往(27．2蒜一100％)。黧侮迸一疹对这黧RGAs进行筛选还有镑磷究。 4．选取RGAn-17-2作为探针，进行柑橘基因组DNA的RFLP分析。从杂交结果可以 看出：RGAn一17—2在不同豹聿嚣橇{孝籽拣壳、丸里香、黄受、菡痰l譬)中郡有若予溺 源片段。 关键词：柑橘；抗病蒸因；抗病基因间源类似物；R—FLP 华孛农韭丈学鞭士学经{龟变Abstract 华孛农韭丈学鞭士学经{龟变 Abstract Citrus is an important economic crop of our country．Its yield resides the 3rd in lhe world+The di seases are key problems that i imi t crop productions． There are 1 imited disease resistance materials in the current cultivars．Cloning the resistance gene from citrus relatiyes is the base for transformation breeding for citrus． To improve the resistance ability is a main target in plant breeding．With development of modern bio—technique，the plant genetic engineering shows good potential for disease resistance breeding．Up to now，some plant resistance genes have been cloned．These R genes are mainly cloned by means of positional cloning or map—based cloning、transposon tagging etc．． In this study，the degenerate primers were designed according to the conservatire domain of plant disease resistance genes．The resistance gene or resistance gene analogy(RGA)fragments were amplified from DNA or eDN