利用透膜荧光小分子探针对半胱氨酸组织蛋白酶蛋白活性表达谱的研究-生物医学工程专业论文.docx

A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Engineering Activity-based protein profiling of cysteine cathepsins using cell-permeable fluorescent probes Candidate : Fengkai Fan Major : Biomedical Engineering Supervisor : Prof. Zhen-li Huang Asso.Prof. Yu-Hui Zhang Huazhong University of Science and Technology Wuhan, Hubei, 430074, P. R. China September, 2012 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本论文属于 保密□， 在 年解密后适用本授权书。 不保密□。 （请在以上方框内打“√”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘 要* 在后基因组时代，最重要的工作就是要从整体水平上了解蛋白质的表达和功能。 在众多的蛋白质分析方法中，蛋白质活性表达谱（activity-based protein profiling, ABPP）是研究酶的表达和功能的主要方法之一，这种方法的主要工具是一种基于酶 活性的小分子探针（activity-based probe, ABP）。ABP 探针是运用有机化学方法人工 合成的靶向性小分子探针，利用它可以将蛋白质组中一类特定的蛋白酶识别标记， 随后通过凝胶电泳、质谱鉴定等方法手段，对酶的表达和功能进行一系列分析。 细胞膜是阻止胞外物质自由进入细胞的屏障，也为 ABP 探针在活细胞内的应用 带来一定困难。突破细胞膜的限制，实现 ABP 探针在活细胞以及在体水平的应用， 是蛋白质活性表达谱研究的重要发展方向。本课题将细胞穿膜肽（cell-penetrating peptide, CPP）应用到 ABP 探针的设计中，合成了针对半胱氨酸组织蛋白酶的特异性 探针：CpFABP 和 TCpABP。利用 TCpABP 探针标记活细胞中的半胱氨酸组织蛋白 酶，对标记蛋白酶进行了基于质谱技术的鉴定分析；将 CpFABP 探针作为一类新型 的溶酶体标记物，对溶酶体依赖型细胞凋亡的起始阶段进行了实时荧光成像分析。 主要研究结果如下： （1）用固相和液相结合的方式合成了针对半胱氨酸组织蛋白酶的一系列 ABP 探针，包括含有八聚精氨酸和环氧探头的 CpFABP、TCpABP 透膜探针以及几种用于 对照实验的探针。通过改进纯化办法，解决了透膜探针在纯化的过程中容易发生环 氧开环的问题，获得高纯度的探针。 （2）TCpABP 探针含有反应基团、荧光基团和 Biotin 基团，是一种具有透膜能 力的三功能（trifunctional）探针。研究结果表明，尽管这种三功能探针含有不能够 透膜的荧光基团和 Biotin 基团，但是因为探针中含有八聚精氨酸穿膜肽，TCpABP * 本课题受到国家高技术研究发展计划 (863 计划) (2008AA02Z107)，国家自然科学基金 ，国家重大 科学研究计划项目 (2011CB910401)的资助。 I II II 探针能够有效透膜进入细胞，实现了在活细胞中对活性状态的半胱氨酸组织蛋白酶 的标记。利用 TCpABP 探针中的 Biotin 基团，我们富集了被标记的活性半胱氨酸组 织蛋白酶，并且通过步骤优化减少了非特异性结合的蛋白，降低了背景蛋白数量。 在经过质谱鉴定之后，我们总共得到 59 个蛋白质，包括 7 种半胱氨酸组织蛋白酶， 其中两种（Cathepsin F, Cath