山羊重组促卵泡素（FSH）在哺乳动物细胞内瞬时和稳定表达研究-动物遗传育种与繁殖专业论文.docxVIP

山羊重组促卵泡素(FSH)在哺乳动物细胞内 山羊重组促卵泡素(FSH)在哺乳动物细胞内 瞬时和稳定表达研究 研究生；王建武 导师：丁家桐教授 (扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009) 摘 要 重组FSH能够避免天然激素制剂在应用过程中的不足，体外重组表达FSH为 新型激素制剂的生产带来了契机。本研究根据已克隆的山羊FSHa、O基因eDNA 序列，构建山羊重组FSH真核表达载体，在哺乳动物细胞内进行了体外瞬时和稳 定表达，为重组制剂的研制提供必备条件。 构建山羊FSHa、p亚基真核表达挚体并在COS-7细胞中瞬时表达。以 pGEM-T-FSHl3为模板，PCR扩增FSHfl基因，‘通过载体与目的基因的双酶切及 DNA连接，将FSHl3基因插入到真核表达载体pcDNA3．0，构建成pcDNA．FSHl3。 从山羊脑垂体组织中提取总RNA，利再jRT-PCR技术成功扩增出FSHa cDNA序列。 经与pcDNA3．0的酶切连接，构建成表达载体pcDNA—FSHa。两载体经序列测定表 明插入的目的基因序列完全正确。用PolyFect转染试剂将两载体转入COS一7细胞 进行瞬时表达，用放射免疫检测表达上清和细胞裂解液，有重组FSH表达，但表 达效率不高。提示要获得高分泌重组产物，必须将a、B基因插入同一载体共表达。 构建山羊FSHa、P双表达载体，在CHO细胞中稳定表达。设计含有酶切位 点和Kozak序列的PCR特异引物，分别以pcDNA．FSHa、pcDNA—FSHp为模板， PCR扩增FSHa、p基因。n、p基因与载体pVITRO-2用限制性内切酶酶切、DNA 连接酶连接，成功构建山羊FSHa、D双表达载体pVITRO．FSHal3。基因序列测定 表明插入序列完全正确。载体用PolyFect转染试剂转染CHO细胞，经潮霉素B抗 性筛选，获得稳定表达山羊FSH的CHO细胞。提取稳定表达的CHO细胞基因组 DNA，PCR检测，表明山羊FSHct、B基因稳定整合到CHO基因组中。培养上清 FSH放射免疫检测，发现有重组FSH的分泌。 本实验首次成功构建了山羊FSHa、B真核表达载体pcDNA．FSHa、 pcDNA．FsH6及双表达载体pVITRO．FSHa[3；在COS一7和CHO细胞中得到了表达， 并获得了稳定表达山羊FSH的CHO细胞。为重组FSH制剂生产及长效激素的研 究奠定了基础。 关键词：山羊FSH；瞬时表达；稳定表达 Studies Studies of Transient and Stable Expression of Goat Recombinant Follicle—Stimulating Hormone in Mammalian Cell Systems M．S．candidate：Wang Jianwu Supervisor：ProE Ding Jiatong (Animal Science and Technology College，Yangzhou University，225009) Abstract Recombinant follicle-stimulating hormone has more advantages than the purified FSH，and would be beneficial to domestic reproduction．Expression of recombinant FSH in vitro might provide a chance to supply commercially．In this study，the eukaryotic expression vectors of goat FSHcq3 were constructed and expressed in COS一7 cells or CHO cells on the basis of the clones of goat FSHa／[3 cDNA，which would have made preparations for recombinant FSH production． Construct eukaryotic expression vectors of gFSH耐p subunits and transiently express in COS-7 cells． The gene of FSH[3 was amplified with PCR as a template of a vector pGEM—T-FSH[3，then expression vector pcDNA3．0 was inserted by FSHl3 gene through double