散发性胃癌BRCA1抑癌基因突变的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

内蒙古 内蒙古科技大学包头医学院硕士学位论文 PAGE PAGE 10 1 前 言 胃癌是消化道常见的恶性肿瘤，发病率很高,在我国每年新发胃癌患者达40 万人，死亡人数达30万人，胃癌已成为中国的第三大常见肿瘤(在男性中排在肺 癌和肝癌之后，女性排在乳腺癌和肺癌之后)。胃癌的发生是多因素多步骤的病 理过程，该过程涉及多种原癌基因的激活和抑癌基因的失活。我们已经研究了 c-erbB-2原癌基因的扩增与散发性胃癌的关系，研究结果显示c-erbB-2原癌基因 扩增与胃癌的发生有一定关系，与进展期胃癌的浸润能力密切相关。现在需进一 步探讨抑癌基因BRCA1的失活与胃癌的关系[1]。 乳腺和卵巢癌易感基因BRCA1 ( breast and ovarian cancer susceptibility gene) 是1990 年由Hall等[2]发现,1994 年由美国科学家Skolnick 等首先成功 克隆定位[3],并命名为BRCA1 ,即人类乳腺癌易感基因。自从BRCA1 分离克隆以来, 大量研究证明：BRCA1基因结构、功能异常与乳腺癌、卵巢癌的发生发展有着十 分密切的联系。BRCA1基因突变者的患癌风险明显高于普通群体,与大约45 %的遗 传性乳腺癌相关[4，5] 。而在除乳腺癌和卵巢癌以外的其它癌症中检测出BRCA1基 因突变的报道并不多见，其与除乳腺癌和卵巢癌以外的其它癌症的关系仍不能确 定，其确切功能和作用机制尚不清楚。为了探讨散发性胃癌患者BRCA1抑癌基因 突变的情况，本文采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR-SSCP）结合银 染的方法，检测了45例散发性胃癌患者BRCA1抑癌基因的突变情况。 2 材料与方法 2.1 检测标本 45 例胃癌组织取自包头市第七医院 2003 年 10 月至 2004 年 10 月期间手术 切除新鲜标本，均经病理诊断为胃癌，其中 38 例取其癌旁正常胃粘膜（距癌灶 边缘大于 10 厘米）作为对照。所有标本立即剔除血块及脂肪组织，置于-20℃冰 箱中冷冻保存。其中男 34 例，女 11 例，年龄 31—78 岁，平均年龄 58.4±10.8。 2.2 试剂与仪器 试剂：PCR 扩增反应体系试剂购自大连宝生物工程有限公司 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自北京鼎国生物技术有限责任公司 引物合成由上海生物工程公司完成 提取 DNA 的试剂盒为上海生物工程公司产品 仪器：PCR 仪（PE480）：The Perkin-Elmer Corporation 紫外透射反射分析仪：上海康禾光电仪器有限公司 DYCZ-24D 型垂直电泳槽：北京六一仪器厂 TS-1 脱色摇床：金坛市华峰仪器有限公司 2.3 方法 2.3.1 DNA 提取 采用上海生工公司生产的 SK1342 临床样品基因组 DNA 小量抽提试剂盒提取 组织中 DNA，作为 PCR 反应的模板。步骤如下： 1） 样品准备：称取 25～30mg 组织样品，用手术刀切成碎末，并收集到 1.5mL 离心管中，用 200uL TE 悬浮； 2） 加入 400μL Digestion Buffer 混匀； 3） 加入 3μL Proteinase K,混匀，55℃保温 3 小时，直至组织完全降解，即 完全透明，不粘稠。 4） 加入 260μL 无水乙醇，混匀，然后将样品全部转移到套放于 2mL 收集管内 的 UNIQ-10 柱中； 5） 10，000rpm，室温离心 1 分钟； 6） 取下 UNIQ-10 柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，加入 500μL Wash solution,10,000rpm,室温离心 1 分钟； 7） 重复步骤 6 一次； 8） 取下 UNIQ-10 柱，弃去收集管中的全部废液，将柱放回收集管中，10,000rpm, 室温离心 30 秒，以彻底除去残留的 Wash Solution； 9） 将柱放入新的洁净的 1.5mL 离心管中，在柱中央加入 50μL Elution Buffer, 室温放置 2 分钟； 10）10,000rpm,室温离心 1 分钟，离心管中的液体即为基因组 DNA。样品置于-20℃ 保存。 2.3.2 引物设计和合成 根据文献报道[6,7]，在 BRCA1 基因可能存在突变热点的区域，选择该基因第 2、 11、20 外显子合成 3 对引物，由上海生物工程公司合成。第一对引物用于特异 性地扩增 BRCA1 基因序列（GeneBank.L78833）第 4557～4814 位的 258 个碱基， 引物序列为： 上游引物：5′- GAA GTT GTC ATT TTA TAA ACC TTT -3′ 下游引物：5′- TGT CTT TTC TTC CCT AGT ATG T -3′ 第