扩增后脂肪源干细胞的成骨分化及体外免疫调节的研究-内科学(血液病)专业论文.docxVIP

前言 前 言 新疆医科大学医学硕士学位论文 新疆医科大学医学硕士学位论文 — — PAGE 11— — — PAGE 10— 前 言 干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，利用其本身的 这种特性，干细胞的应用涉及了心血管疾病、自身免疫性疾病、恶性血液病、糖尿 病、严重烧伤和遗传免疫缺陷等疾病的治疗，因此，成为生命科学和生物医药领域 最受观注的热点之一。目前干细胞的来源主要有两种. 即胚胎干细胞(embryonic stem cells ， ESC) 和成体干细胞( adult stem cells ，ASC) 。胚胎干细胞( ESC) 由于涉及 伦理、道德及对其分化能力控制等各方面问题，目前各国对 ESC 的研究普遍持谨慎 态度[4]； 成体干细胞(ASC) 的应用目前以骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived stem cells，BMSC）为主，但由于 BMSC 取材困难、获得率低(约 1 × 105 个骨髓细胞 中方能获取一个 BMSC ) ，故其临床应用前景也明显受到限制[3]。继 BMSC 之后， 脂肪源性间充质干细胞(adipose - derived stem cells，ADSC) 成为当今干细胞研究领 域的又一热点。 2001 年，美国的 Zuk[1]等人首先以胶原酶消化的方法从脂肪组织中分离出具有多 向分化潜能和自我更新能力的细胞株，即为脂肪源干细胞(ADSCs) 。由于脂肪组织 同骨髓均自中胚层发育而来并同样含有易分离的基质成分，故脂肪源性间充质干细 胞与骨髓间充质干细胞有许多相似的生物学性质[5-7]， 但 ADSCs 同 BMSCs 相比具 有如下优势[8-13]： ①来源：骨髓间充质细胞需对患者进行骨穿并通过密度梯度离心 法获得，而皮下脂肪组织的获取相对容易且通过简单的消化离心法即可获得； ②体 外扩增：由于获得骨髓基质细胞的数量相对较少， 而 300 mg 正常脂肪组织经处理 后即可获得 2 - 6 × 108 个 ADSCs 细胞，细胞充足；③BMSCs 的增殖和分化需特定 血清或基质补充，而 ADSCs 细胞则不需要特定血清或基质补充且可以稳定增殖，仅 伴有低水平衰减。因此，目前利用脂肪源干细胞多向分化能力的临床应用研究已逐 步展开。 在成脂分化方面，ADSCs 经过长时间的体外培养后仍维持此种分化潜能[14] 。 噻唑烷二酮(thiazolidinediones) 与糖皮质激素(glucocorticoids) 可以协同刺激 ADSCs 向脂肪细胞分化，使细胞脂滴形成，明显增加脂肪细胞特异的甘油磷酸脱氢酶( GPDH) 和瘦素(leptin) 的表达。外源性的添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 或转染 bFGF 则明显促进 ADSCs 增殖，在成脂肪细胞分化条件的诱导下转染 bFGF 的细胞停止 增殖，并开始向脂肪细胞分化，ADSCs 可能是人脂肪组织再生较合适的细胞来源 [15-16]。 ADSCs 向软骨细胞分化的基础培养基是 DMEM/ 1 %FBS ，在基础培养基中加 入胰岛素，TGF - ? 和抗坏血酸，诱导分化后的细胞分泌Ⅱ型胶原和蛋白多糖。ADSCs 在藻酸盐培养体系中，经成软骨诱导 2 周后，大量合成Ⅱ型胶原、Ⅳ型胶原及硫酸 软骨素，将诱导后细胞与藻酸盐复合物植入裸鼠皮下 12 周后形成软骨样组织，免疫 组化显示软骨特异的细胞外基质成分合成明显增多[17] 。在成软骨细胞诱导过程中 ITS 及 TGF - ? 明显刺激细胞增殖和蛋白多糖的合成与沉积，而地塞米松则不利于蛋 白多糖的合成及沉积。转染绿色荧光蛋白( GFP) 的 ADSCs 仍具有多向分化潜能， 且随其传代及分化荧光的强度并不衰减，说明 ADSCs 可以稳定表达外源性基因，因 其易于鉴定及示踪可能会成为体内体外软骨组织工程研究中的首选细胞[18-21] ；而且 ADSCs 与 BMSCs 的成软骨能力相似。在成软骨诱导培养的方法上，目前多数研究 采用聚集培养或藻酸盐微球培养进行诱导。 ADSCs 向成骨细胞分化的诱导条件为 DMEM/ 10 %FBS 培养基中加入地塞米 松、抗坏血酸、?- 甘油磷酸钠。诱导分化 2 周，约有 50 %的细胞碱性磷酸酶呈阳 性表达，有钙化斑出现[22] 。生长因子的浓度对其分化能力也有影响，添加 1 ng/ mlbFGF 则 ADSCs 易于向成骨细胞分化， 而添加 1 000 ng/ ml bFGF 则 ADSCs 易 于向脂肪细胞分化[27] 。将 ADSCs 与 BMSCs 分别接种于胶原或 ?- 磷酸三钙支架 上，经成骨分化诱导，体内和体外结果显示 ADSCs 与 BMSCs 具有同样的成骨特性 [28] 。将 ADSCs 接种于聚乳酸