亮斑扁角水虻新抗菌肽基因的发掘及其抗菌功能研究.pdfVIP

亮斑扁角水虻抗菌肽的基因筛查及其肠道微生物的分离和研究 4.2.3 主要试剂 41 4.2.4 琼脂糖凝胶电泳相关试剂配制 41 4.2.5 主要设备 41 4.3 实验方法 42 4.3.1 亮斑扁角水虻肠道菌枯草芽胞杆菌的分离 42 4.3.2 亮斑扁角水虻肠道菌对植物病原菌的抗菌谱测定 42 4.3.3 菌株BSF-CL的分类鉴定 42 4.3.4 活性物质分子检测 42 4.4 实验结果 45 4.4.1 亮斑扁角水虻肠道菌枯草芽胞杆菌的分离结果 45 4.4.2 亮斑扁角水虻肠道菌BSF-CL抗菌谱检测 45 4.4.3 菌株BSF-CL分类鉴定 46 4.4.4 BSF-CL活性物质的分子鉴定 48 4.5 讨论 49 参考文献 50 致 谢 55 附录 1 56 iii 万方数据 亮斑扁角水虻抗菌肽的基因筛查及其肠道微生物的分离和研究 摘 要 抗菌肽(antimicrobial peptides)是生物体内广泛存在一种具有抗菌作用的活性多 肽，它是生物体内非特异性免疫防御系统中的一种免疫应答产物，它的抗菌谱非常 广。双翅目昆虫亮斑扁角水虻能生长在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环 境中，其自身却不会因为感染病原菌而引起死亡，这说明亮斑扁角水虻或者其肠道 共生菌对病原微生物有很强免疫力。本文从亮斑扁角水虻自身产生抗菌肽及其肠道 细菌两个方面进行研究，发掘新的抗菌肽和肠道抗菌微生物。主要研究结果如下： 根据 APD 等抗菌肽数据库中昆虫（主要是双翅目昆虫）抗菌肽的保守区序列设 计了 37 对兼并引物进行抗菌肽基因筛查，从经过大肠杆菌和金黄葡萄球菌同时针刺 诱导后的亮斑扁角水虻幼虫中扩增出了 3 类抗菌肽 cecropin、sarcotoxin、stomoxyn 中的7 个基因片段，分别编号为 cecropin，sarcotoxin1，sarcotoxin1(a)，sarcotoxin1(b)， sarcotoxin3，stomoxyn ，stomoxyn(a) 。其翻译后氨基酸序列与对应的原始序列进行 比对分析，相似度分别为 46.29% 、44.44% 、46.29% 、46.29% 、42.55% 、46.29% 、 46.29% 。我们同时对 7 个基因片段进行了生物信息学分析，预测其可能存在的二级 结构和三维结构。经预测分析后发现，7 个基因片段所预测的蛋白结构与对应原始 序列的蛋白有相似的结构也有不同的活性区域。通过序列的比对分析结果及其蛋白 的结构预测分析，确定7 个抗菌肽基因均为新的抗菌肽基因。 选择抗真菌肽 stomoxyn 基因进行表达，本实验成功地将 stomoxyn 基因连接到 酵母分泌表达载体 pPICZαA 上，并在毕赤酵母 GS115 中进行了表达，实验结果表 明在利用 1%甲醇诱导72 h 的时候表达量最高。分离表达蛋白进行抗菌功能检测， 结果显示表达的 stomoxyn 抗菌肽，具有广谱抗菌活性，可抗革兰氏阳性细菌金黄葡 萄球菌，革兰氏阴性菌大肠杆菌和真菌稻瘟病病原菌。 另外，我们从昆虫亮斑扁角水虻分离的肠道细菌进行抗植物病原菌的拮抗菌筛 选。采用平板对峙法进行抗菌筛选，从亮斑扁角水虻的肠道分离的 11 株细菌中，筛 选出一株对水稻白叶枯病原菌有较强抑制效果的菌株 BSF-CL ，经生理生化和 16