蛋白定量与纯度分析.ppt

浓度测量的相对误差与溶液透射率(T)的关系如图所示：图1 3.2比色测定呈色反应 在定量分析中，有许多物质的测定是通过化学反应生成颜色后再进行比色测定，一般要注意下列问题 (1)颜色反应后的生成物必须在选定测定波长有较大的光吸收 (2)颜色反应后生成物理化性质必须稳定，显色条件容易控制，重复性好 (3)对照性好，反应物和生成物之间的最大吸收波长之差，差值一般要在60nm以上。 3.3参比溶液的选择 根据样液的性质不同，可选择不同的参比溶液。 (1) 溶剂参比：当样液的组分比较简单，与其它组分共存对所测定波长无任何吸收剂为参比。 (2) 溶液参比：参与反应的试剂在所测定波长部分干扰，可按照显色反应的条件，选用不加被测试样品的溶液为参比。 (3)纯水参比：试样与共存组分在测定波长均有较大的吸收，可选用水为空白，先测出试样和对照的光吸收值，然后用试样的吸收值减去对照的光吸收值即可。 . 4定量分析小结 方法 机理 关键技术 优点 缺点 比色法 光互补色 呈色反应 应用广泛 影响因素多 紫外法 最大吸收峰 蛋白质纯度 操作简单 基准物有局限 定氮法 转化氮元素 蛋白质消化 结果准确 步骤繁琐 重量法 冰点升华 样品恒重 结果准确 专一性差 第二节 蛋白质纯度 1概念 1.1蛋白质纯度 蛋白质的纯度分析，是从蛋白质样品中确定目标蛋白和杂质的分析方法，也是蛋白质分析中的一类重要方法。任何一个蛋白质制品从理论上说都含有二类组分，即蛋白质和杂质。 蛋白质：是样品中主要的成分，是分析的目标蛋白 杂质：是残留的非目标蛋白和残留的小分子，无机盐等 因此，蛋白质纯度分析方法大致分为两类。 (1)目标蛋白与杂蛋白的分析 (2)目标蛋白与非蛋白的分析 从广义上说蛋白质纯度一般是指样品中是否含有杂蛋白的，不包括无机盐和有机小分子的分析鉴定。因为有些蛋白质要在一定无机盐和有机小分子的保护下才比较稳定。因此，某些产品中要添加一些小分子化合物。但是如果要进行蛋白质的含量测定，则要包括杂蛋白，无机盐和有机小分子的测定。 1.2蛋白质纯度的表示方法 一个天然蛋白或一个重组蛋白质，产品的纯度是一个重要的指标。纯度的表示方法主要根据实际用途区分。如化学试剂的纯度一样，主要有化学纯，分析纯，优级纯等。蛋白质的纯度通常有两种方式表示。 (1)工业用的用百分含量表示：如：95％、99％、99.9％ (2)实验室用的以用途表示： 有实验室级纯(1ab) 电泳纯(electrophoresis) 色谱纯(choromatography)。 2分析的方法： 2.1光谱法： 2.1.1光谱扫描法： 一种纯度的蛋白质溶液在一定的波长范围内进行光谱扫描就会得到一个特征吸收光谱，可以根据扫描光谱的吸收曲线的形状，吸收峰的位置，数量和大小判断该蛋白的纯度。 用紫外吸收光谱测定样品的纯度，既方便又灵敏，测得结果可靠，是常用的纯度分析方法。 光谱分析的特点：主要是鉴别目标蛋白质和非蛋白类杂质。 2.1.2光吸收比值法： 一种纯物质在紫外光区有其最大光吸收峰，如核酸的最大吸收峰在260nm，蛋白质的最大吸收峰在280nm。同一溶液在这两种波场下测得的光吸收值是不同的。利用在280nm和260nm处测得的光吸收值之比，即可得到蛋白质的纯度。如纯核酸的标准光吸收比为A280/A260 = 0.5、纯蛋白的标准光吸收比为A280/A260 = 1.8。 特点：仅限于蛋白质溶液中含有核酸或核酸溶液中含有蛋白质的纯度测定。 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml) 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的 2.2层析法： 2.2.1原理：一个纯的蛋白质在稳定的层析条件下，得到的保留值只有一个，如果得到的层析峰多于一个就可以视为不纯。所以根据层析峰的数量判断物质的纯度。层析法鉴定蛋白质纯度的方法有： (1)保留值法 在一定的层析条件下各种蛋白质组分在层析柱内的保留值是一定的，通过测定蛋白质的层析保留值(保留时间，保留体积)就能确定蛋白质组分，从而可以判断蛋白质的纯度。如：排阻层析根据蛋白质不同的分子量可得到不同的保留体积，若流速恒定的条件下，其保留时间也是一定的。图2 (2)基准物标定法： 已知物内标法，在被鉴定物的样品中加入己知基准物，称内标物。通过层析分离，从得到的层析峰的