PCR的种类及应用.pptVIP

一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 　　巢式PCR，可以在106基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，但也是最容易污染的PCR。 Touchdown PCR 用来避免非特异性序列的扩增 PCR中引物的黏合温度(annealing temperature)决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。 递减PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。 * * 鉴定基因 亲子鉴定 诊断遗传病 克隆基因 诱变 分析远古DNA 鉴定特定表型的突变体基因 比较基因表达量 PCR的应用 * * 杨坤，优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究[J] 2010.10：5002-5005 8 王静，反向PCR分离侧翼序列技术研究进展[J]2010.3：200-202 马沁沁，水稻花药绒毡层特异表达启动子的分离与表达载体构建[J]2010.11（4）：200-205 10 张于勤，多对型特异性引物巢式PCR检测乙型肝炎病毒基因型分析[J]2010.7（13）：1306-1308 谢谢 PCR的种类及应用 学号 王志慧 序 * * PCR的历史 操作过程 引物 步骤 PCR的各种变体 PCR的应用 鉴定基因 亲子鉴定 诊断遗传病 克隆基因 诱变 分析远古DNA 鉴定特定表型的突变体基因 比较基因表达量 目录 * * PCR这项技术是由凯利·穆利斯(Kary Mullis)发明，并因此在七年之后，1993年10月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，和反复相同程序的方法，并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。 PCR 历史 * DNA的复制 DNA在复制时，双链DNA解旋成两股分别进行。其复制过程的复制起点呈现叉子的形式，故称复制叉。以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向连续合成，称为前导链(leading strand)；另一条模板链为5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的DNA链，该链称为后随链(lagging strand)。 * * ①5’→3’的聚合作用：不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 ②3’→5’的外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。 ③5’→3’外切酶活性：切除受损伤的DNA，可用于切口平移（nick translation). 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌，能在70-75℃生长.存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。 该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成， 但