PCR实验室检测技术.pptVIP

琼脂糖凝胶电泳分析注意事项 电泳上样时避免PCR产物漂移到其他孔而影响结果判定。 用电泳缓冲液制备琼脂糖凝胶。 溴化乙锭（EB）为强致癌物质，必须戴手套谨慎操作，摇动时不要外溅。 四、PCR检测常见问题与解决途径 利用PCR方法检测时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。为了提高检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。 （一）假阳性： 造成假阳性的原因 1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染； 2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。 3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。 4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。 假阳性问题的试验控制 在每次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。 （二）假阴性 如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。但这里应注意，许多国产PCR试剂盒中阳性对照采用质粒DNA，和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。 造成假阴性原因： 1.仪器因素 2.试剂质量问题 3.核酸模板问题：模板中含有杂蛋白质；模板中含有 Taq 酶抑制剂；模板核酸变性不彻底等。 4.操作人员素质问题：PCR实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性。 （三）污染处理 1. 提取时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。 2. 用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。 3. 玻璃器皿干烤：180℃ ，8小时或更长时间；小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。 4. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 谢 谢！ * 移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性 * 加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均 PCR实验室检测技术 宁夏动物疾病预防控制中心 2011.08.04 PCR检测技术 一、 PCR技术原理 DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。　 　 PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火)、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下一般都可见到DNA的特异扩增条带。 二、PCR技术工作流程及注意事项 （一）PCR实验室的布局 PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，这也是最容易造成假阳性原因之一。实验室布局应重点考虑避免这种污染。因此用于PCR检测的实验室要进行功能区域划分，从对环境要求的严格程度和功能上可将PCR整个实验流程划分为四个区域： 1.配液区（准备区） 2.模板提取区 3.PC