分离细胞培养物—悬浮型细胞的传代过程.PPTVIP

第三节 细胞工程技术制药 一、细胞培养基本概念 从体内组织取出细胞，在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。 可以是单个细胞，也可以是细胞群 二、细胞培养目的与用途 生物药物研究及生产 新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。 疫苗研究与生产：如病毒性疫苗的研究与生产（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 基因工程药物研究与生产：如干扰素研究与生产，细胞生长因子研究与生产等。 细胞工程药物研究与生产：生物活性多肽研究与生产，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与生产。 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。 基础研究 药物作用机理 基因功能 疾病发生机理 三、细胞培养设施和基本条件　 实验室设计 细胞培养室和设计原则：防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境 清洁、空气清新，干燥和无烟尘。 细胞培养工作包括：工作液配制、无菌操作（采样）、温育、无菌处理，细胞和用品贮存等。 细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室 常用设施及设备 超净工作台：净化工作台 无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作 台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无 菌物品等。 操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物品。 洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。 分析间：显微镜、计算机及打印机等。 培养器皿 液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体。 培养瓶：用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。 培养皿：用于开放式培养及其它用途。 吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。短吸管也叫滴管， 分弯头和直头两种。 离心管：根据用途不同形态各样，常用 于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。 培养用品的清洗与消毒 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。 微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。 对新使用和重新使用 的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法 培养用品的清洗与消毒 玻璃器皿的清洗 清洗过程：浸泡、刷洗、侵酸和冲洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质 浸泡 新的初次使用的玻璃器皿：玻璃表面带有大量灰 尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。 新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。 再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。 浸酸 清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。 浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于 6 小时。 清洁液配制的强度，常用的下列三种： 强清洁液：重铬酸钾63g ，浓硫酸1000ml ，蒸馏水200 ml 次强清洗液：重铬酸钾120g ，浓硫酸200ml ，蒸馏水1000 ml 弱清洁液：重铬酸钾100 g ，浓硫酸100 ml ，蒸馏水1000 ml 配制过程注意事项 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。 不停的用玻璃棒搅拌， 使产生的热量挥发 配制溶液应选择塑料制品。 配成后清洁液一般为棕红色 冲洗 冲洗最好用洗涤装置。即省力、效果又好。 用手工操作，则需流水冲洗 十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗 3-5 次，晾干备用 胶塞的清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理 常规清洗方法：每次用后立即置入水中浸泡，然后用 2% NaOH 或洗衣粉煮沸 10～20 分钟，以除掉培养中的蛋白质。 1%稀盐酸浸泡 30 分钟或蒸馏水冲洗后煮沸 10～20 分钟，晾干备用。 塑料制品的清洗 塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。 必要时用 2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用 5%盐酸溶液浸泡 30 分钟，最后用自 来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。 消毒 常见的原因 操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不 合格或不彻底 由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节