糖尿病心肌病患者血清差异表达microRNA及作用的研究.docVIP

糖尿病心肌病患者血清差异表达m i croRNA及作用的 研究 ［ ］目的筛选糖尿病心肌病患者血清差异表达的microRNA (miRNA),明确miR-186-5p和miR-516a-5p在DCM发生发展中的作用和 机制。方法选择30例DCM患者为实验组，60例年龄相当的身体健康者为 正常对照组，分别从两组随机选取3例作为研究对象行microRNA芯片初 筛差异表达miRNA,然后荧光定量qPCR验证这些miRNA的差异表达；在高 糖诱导人AC16心肌细胞损伤模型中，miRT86-5p和miR-516-5p的mimics 和inhibitors分别干预，观察对高糖引起的心肌细胞毒性的影响。结果 microRNA芯片检测发现，糖尿病心肌病患者血清有51个差异表达的 miRNA,经荧光定量qPCR验证为miR-186-5p、miR-516a-5p等8个差异表 达miRNA；显著高表达的miR-516-5p和明显低表达的miR-186-5p介导了 高糖所致心肌细胞毒性损伤。结论糖尿病心肌病患者血清miRNA表达谱发 生改变,有8个差异表达miRNA, miR-516a-5p和miR-186-5p可能参与糖 尿病心肌病的心肌损伤发病过程。 ［关键词:microRNA；糖尿病；糖尿病心肌病；心肌损伤 糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是独立于高血压、 冠心病及心脏瓣膜病变的一种糖尿病心脏并发症，与糖尿病患者心血管疾 病的高发牛率及高病死率密切相关，越来越受到重视。糖毒性、脂毒性、 氧化应激、线粒体功能障碍、内质网应激、心肌细胞凋亡、炎症等众多因 素与DCM心肌损伤密切相关，其中心肌细胞凋亡与炎症是DCM的主要发病 机制之一，然而具体分子机制尚不清楚。 MicroRNA (miRNA)是22-24nt的一种非编码RM,能通过碱基配对的 方式特异性结合目的mRNA 3,非编码区域负性调控其表达，在细胞分化、 增殖、代谢、细胞凋亡和迁移等生物学活动屮发挥一定作用。新近研究表 明：MicroRNA在心脏纤维化、心律失常、心肌缺血、心衰等心脏疾病中具 有重要作用；体内外实验研究提示，MicroRNA表达异常可能在糖尿病心肌 病发病机制中起到重要作用。 因此，为了深入阐明DCM心肌损伤的发病机理，为了明确MicroRNA 在DCM心肌损伤中的具体作用与机制，本研究拟采用microRNA芯片筛选 DCM患者血清差异表达miRNA,并且荧光定量qPCR验证之；在高糖诱导人 AC16心肌细胞损伤模型中，使用miRNA的mimics和inhibitors分别干预, 观察对高糖引起的心肌细胞毒性的影响。 1材料与方法 1材料 D-葡萄糖购自美国Sigma-Aldrich公司。胎牛血清(GIBICO), DMEM 培养基(Hyclone),青链霉素(Hyclone),胰酶(Hyclone), PBS磷酸钾 缓冲液(Hyclone ) 。 miR-186-5p inhibitor 、 miR-186-5pmimics 、 miR-516a~5p inhibitor＞ miR-516a~5p mimics (广州锐博生物科技有限 公司)，miRcnte miRNA提取分离试剂盒＞ miRcute miRNA cDNA第一链合 成试剂盒＞ miRcnte miRNA荧光定量检测试剂盒(TIANGEN), Lipofcctamine 3000 Transfection Reagent （Invitrogen 公司），Opti-MEM 培养基 （Invitrogcn公司），CCK-8 （碧云天），30%丙烯酰胺混合溶液（碧云天）。 人microRNA芯片版本为ag订ent V19。 1?2方法 1.2. 1纳入研究的DCM患者一般资料与血液样本采集选择2012年6 月?2015年7月期间在广东医学院附属医院心血管内科住院的糖尿病心肌 病患者30例，健康组60例。诊断标准参照以往文献报道，具体如下：（1） 确诊糖尿病病程5年以上；（2）心脏扩大、心力衰竭、心绞痛或心律失常 存在；（3）无冠状动脉大小血管和微血管病变；（4）无英他原因的心肌病 和心脏病。排除标准如下：（1）急性脑梗死患者；（2）自身免疫性疾病; （3）使用激素或免疫抑制剂者；（4）发病前2周有炎症、感染性疾病；（5） 依从性差不能完成相关指标测定的患者。本研究经广东医学院附属医院伦 理委员会审核通过，参与木研究的所有患者均签署了知情同意书。采集DCM 患者外周静脉血10mL,将其置于不含抗凝剂的收集管屮，室温静置30min 后，4000r/min离心20min,离心留取上清低温冰箱保存备用。 1.2.2人MicroRNA芯片筛查与qPCR验证采用人microRNA芯片