一种新的短小芽孢杆菌胶原蛋白酶的分离、纯化及酶学性质研究.pdfVIP

离到2种胶原蛋自酶疆。MerkelJ菇71等人从海水中分离到一株被认为是非致病菌株的具有 该酶是一种金属蛋白酶，能降解可溶，和不溶性胶原，且最适反应pHi7。6，最适反应 温度为37C。 1．3其它菌来源的胶原蛋白酶 的胶原酶。生长在含多肤培养基上时，酶活可大大提高。杨光盎等分离出具有较高胶原 蛋白酶活性的铜绿假单胞菌阎，徐宁等对发光杆菌产胶原酶发酵条件徽了研究网。这些 虽然都可以产生胶原蛋白酶，但是它们产生的酶的酶学性质和用途等方面有所不同。另 外本实验室也筛选到了一株具煮消化能牛皮的能产胶原蛋白酶的短小芽孢杆菌‘捆。 2胶原蛋白酶酶活测定方法 2．1完全酶解标准法 Paul M．Gallop等(1957)用胶原蛋白酶对胶原进行完全酶解，将产物作为比色标准， 用Lowry法测定蛋白含量。 Ca2+， 该法以鱼胶为酶促反应底物，其具体过程为：准确称量8mg鱼胶，溶于5mmol／L mL酶液。振荡反应20min，加入0．5mL pH7．5的缓冲溶液2mL。37(2振荡预热，然后加入0．5 95％的乙醇终止反应后进行酶活性测定。然后取0。lmL稀释成l mL，以没有加酶液的为 对照，同样采用Lowry法测定其中的蛋白含量或者多肽含量。对酶活力定义为：在以上 的测定条件下，降lmg胶原所霈要的胶原蛋自酶的量为1个酶活力单位flll。 2．2粘滞系数法 Paul M。Gallop等还提出了第二种测定方法。由予鱼胶溶液的糙度与其浓度存在如下 的关系：rlsprlrel．1 一起置于粘度计中，在同样的时闻间隔(时闻闻隔不少于3次)，读取其糙度和浓度，计算 鱼胶的相对粘度。然后以相对黏度为纵坐标，时间为横坐标制作半对数曲线，通过改变 参加反应的总酶活力数(已知)作溉多条实验曲线，邃线的斜率与各总酶活力数之毙为～ 常数。曲线确定后，斜率随之确定。通过这种先确定常数然后根据曲线斜率求得待测样 ’ 瑟的总酶活力数l’n。 2．3Azocoll法 2 Azocoll为一种特定的底物蛋白，不能被一般的蛋白酶所水解，但能专一性的被胶原 蛋白酶和其他少数酶类所水解。Osamu Acid 了细微改进，具体测定方法如下：以双辛丁酸法总蛋白检测试剂盒【4](Bicinchoninic Protein 酸盐溶液中配置成一定浓度的底物溶液，然后与定量的酶液混合，37℃反应1h，离心取 上清用双辛丁酸法总蛋白检测试剂盒于520nm测定光吸收值。酶活定义为：每分钟使A520 光吸收值下的增加1．0为一个酶活力单位‘121。 2．4千重差量法 Howard Tint等人在1960年提出了一种简单快速定量测定胶原蛋白酶活性的方法。 胶原与胶原蛋白酶作用30rain后，先将没被降解的胶原用蒸馏水清洗，再用丙酮反复清 洗2次，高温干燥。同时用等量的不加胶原蛋白酶组作为对照。充分干燥，称重计算二 者质量差。依据底物质量减少的百分比与不同浓度胶原蛋白酶的对数得到几个线性关系 图，得出的斜率为常数。他们总结出降解50％底物(ED50)所需要的的酶液体积数与其他 量的关系可以用如下标准方程来表示：log 白酶液体积数，a为斜率常数，y表示标准底物重量减少的百分比，利用这个标准方程可 以计算出所用胶原蛋白酶的体积数，浓度已知，便测定出了该酶的酶活【13】。 2．5茚三酮显色法 日本的Hiroko 定方法【14】： 50mmol／LTris．HCI4mmol／L (1)以不溶性胶原作为底物，反应体系为：0．8mL pH7．5 0．1mol／L的醋酸终止反应。然后测定水解释放出来的氨基酸。酶活定义为：每分钟每毫克 蛋白产生相当于等量亮氨酸微摩尔数为一个酶活力单位。 (2)以酪蛋白作为底物，反应