收集吸附细胞色素C的人造沸石.ppt

工艺过程： ①菌种培养 大肠杆菌37℃培养24h普通牛肉培养基; ②种子培养 16％玉米浆，接种量 1～ 1.5％，37℃，通气搅拌培养 4～8h; ③发酵罐培养 玉米浆培养基，接种量 8％，37℃通气搅拌培养 6～ 8h，离心分离发酵液，得菌体，加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉. ④提取、沉淀、热处理　每千克菌体干粉加入0.01 mol/LpH8的硼酸缓冲液10L37℃搅拌1.5h，30℃8mol/L醋酸调节pH4.2～4.4，压滤，滤液加入2倍体积的丙酮，放置3～4h过滤，收集沉淀，自然风干，得干粗酶. 取粗制酶，加入0·3％甘氨酸，调节pH8.8搅拌1.5h离心，上清液60℃30min热处理。上清液加 2倍体积的丙酮，析出沉淀，离心，收集酶沉淀，0.01mol/L，pH8磷酸缓冲液溶解，离心得上清酶溶液. ⑤精制、冻干 调节pH8.8离心弃去沉淀，清液再调 pH7.7加入50％聚乙二醇，浓度达到 16％。2～ 5℃放置 4～ 5天，离心得沉淀。蒸馏水溶解加 4倍量的丙酮沉淀，同法反复 1次，pH6.4,0.05mol/L磷酸缓冲液溶解，50％聚乙二醇处理 1次，即得无热原的 L一天门冬酸胺酶。溶于 0.8mol/L磷酸缓冲液，在无菌条件下用 6号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥制得注射用 L一天门冬酸胺酶成品，每I支 1万或 2万单位。 五、细胞色素C（Cytochrome C） 细胞色素：来自三羧酸循环中产生的琥珀酸辅酶A，其肽链仅有104个氨基酸，体内大量存在，一般无需外源补充；且外源补充与体内含量相比甚微。细胞色素C是生物氧化的一个非常重要的电子传递体，在线粒体崤上与其它氧化酶排列成呼吸链，参与细胞呼吸过程。 细胞色素C是中枢兴奋药，用于急救或辅助治疗各种原因引起的组织缺氧，如一氧化碳中毒，安眠药中毒、高山缺氧等，亦可用于脑缺氧、心肌炎、心肌代偿不全、心绞痛、心肌梗塞、肝炎、肾炎等。 细胞色素种类较多，可以用光谱学、血红素基团的精确结构、抑制剂的敏感度以及还原电势的大小来分辨。 根据辅基的不同，可以将细胞色素大致分为三类： 细胞色素a 血红素a（原血红素） 细胞色素b 血红素b（甲酰血红素） 细胞色素d 二氢卟酚（Chlorin）的衍生物 细胞色素c：与其他三类细胞色素非共价结合血红素不同的是，细胞色素c通过分子中的半胱氨酸巯基与血红素共价结合。 工艺路线： 新鲜猪心 绞碎 心肌碎肉 H2SO4 pH4 提取液 氨水,人造沸石 吸附物 25%(NH4)2SO4 洗脱液 (NH4)2SO4 滤液 [浓缩] 沉淀物 [透析] 粗品溶液 [吸附] 吸附物 [洗脱] 洗脱液 pH7.5 比重1.21~1.23 CCL3COOH 蒸馏水 Amberlite IRC-50 [原料处理] [提取,压滤] [中和,吸附] [盐析] [洗脱] NaHPO4-NaCl 精品溶液 蒸馏水 pH6.4 [透析] 成品 双甘肽,NaHSO4 [制剂] 工艺过程： ①绞碎、提取、压滤 取新鲜或冷冻猪心，去血块、脂肪和肌健等，绞肉机中绞碎。称取心肌碎肉，加1.5倍量蒸馏水搅拌均匀，用硫酸调pH4左右，常温搅拌提取压滤，滤液用氨水调节pH6.2，离心得提取液。心渣再加等量蒸馏水同上法重复提取1次，合并两次提取液。 ②中和、吸附、洗脱 提取液加氨水中和至pH7.5，在冰箱中静止沉淀杂蛋白，吸取上层清液，每升提取液加入10g人造沸石，搅拌吸附40min，静置倾去上层清液。收集吸附细胞色素 C的人造沸石，用蒸馏水和氯化钠溶液反复洗涤，然后装柱，用 25％硫酸氨溶液洗脱，得洗脱液。 ③盐析、浓缩、透析 洗脱液加入固体硫酸镀达到 45％饱和度，使杂蛋白析出，过滤。收集透明滤液，缓缓加入 20％三氯醋酸，边加边搅拌使细胞色素 C沉淀析出，离心收集沉淀。再将沉淀溶于蒸馏水，装入透析袋中，透析至无硫酸根为止，过滤得细胞色素C粗品溶液。 ④吸附、洗脱、透析 粗品溶液通过处理好的 Amberite IRC－50（NH4＋）树脂柱吸附，然后将树脂移入大烧杯中，水洗至澄清为止，再分别上柱，用0·6mol/L磷酸氢二钠与0.4mol /L氯化钠混合液洗脱，洗脱液用蒸馏水透析去氯离子，得细胞色素C精品溶液。 ⑤制剂 取含相当于1.5g的细胞色素C精品液，加200mg亚硫酸氢钠，搅拌溶解再加双甘肽1.5g混合均匀，用氢氧化钠调节pH6.4左右，加注射用水100ml，过滤除热原，6号垂溶漏斗过滤，测含量，灌注，冷冻干燥，即得每支含15mg细胞色素C的制剂。 酶的制剂形式： 结晶： 固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）