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五味子特殊类型白果五味子ITS2序列鉴定探究 ［摘要］目的：以ITS2片段作为DNA条形码，在分 子水平上研究白果五味子。方法：结合五味子和华中五味子 样品对白果五味子进行研究，对样品ITS2片段进行双向测 序，CodonCode Aligner拼接序列，利用MEGA 5. 0进行多序 列比对，利用ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构，应 用BLAST 1方法进行鉴定分析。结果：白果五味子样品ITS2 序列长度为231 bp, BLAST 1鉴定白果五味子样品为五味子。 白果五味子和五味子居群间平均K2P ( Kimura-2- parameter)遗传距离(0.002 2)远远小于五味子和华中五 味子的种间平均K2P遗传距离(0. 021 6)o结论：ITS2鉴定 白果五味子属于五味子；ITS2可以用于鉴定和区分五味子和 华中五味子。 ［关键词］五味子；ITS2；居群；DNA条形码 ［收稿日期］2013-11-15 ［基金项目］国家科技基础性工作专项重点项目 (2007FY1106002010)；辽宁省教育厅项目(LT2010067) ［通信作者］王冰，教授，博士生导师，主要从事药用 植物种质资源与质量研究,Tel: E-mail： wangbingl616@163. com ［作者简介］李先宽，博士研究生，主要从事药用植物 种质资源与质量研究，Tel:, E-mail : lixiankuanl68@163. com 五味子为木兰科多年生落叶木质藤本植物五味子 Schisandra chinensis (Turcz. )Baill 的干燥成熟果实［1］, 是历代药典收载的常用药材。作为一种传统中药，常用于治 疗干咳，哮喘，盗汗，遗精和慢性腹泻等［2-3］ o五味子是 辽宁省最重要的道地药材，由于近些年五味子的广泛种植， 其广泛的种源，即种质资源来源不一致是影响五味子质量的 一个重要因素［4］。从2008年开始，本课题组一直追踪观察 辽宁省栽培五味子所结果实为白果的一种特殊类型一一白 果五味子［5］,其药材质量的优劣是一个需要认真研究的问 题。ITS2片段具有适合扩增和测序的长度，在物种水平的变 异较快，有更多的突变位点以区分不同的物种，因此，在DNA 条形码鉴定物种方面具有潜在的研究价值。本研究利用核基 因ITS2片段作为DNA条形码［6-10］,结合五味子和华中五 味子，在分子水平上对白果五味子基原植物进行研究，探索 白果五味子和五味子的亲缘关系，提供白果五味子DNA分子 水平的鉴定资料，为明确辽宁省道地药材五味子种质资源的 遗传多样性以及合理保护和利用五味子种质资源提供理论 依据。 1材料与方法 1. 1材料供试样品（植物叶片）于2012年6-9月采 集，包括3个栽培居群和3个野生居群，共计53份样品， 包括五味子和华中五味子2个物种。样品经硅胶迅速干燥后, 置于-86 ￡超低温冰箱保存备用。白果五味子有针对性的取 8个样株，在同一农场内随机取正常的五味子5个样株，其 他样品均为随机取样，样品信息见表lo样品经辽宁中医药 大学药学院王冰教授鉴定为五味子S. chinensis和华中五 味子S. sphenanthera Rehd. et W订s.,凭证标本保存于辽 宁中医药大学药用植物实验室。 1.2仪器和试剂台式冷冻离心机（Fresco）、数显恒温 水浴锅（HH-S型，巩义市予华仪器有限责任公司）、PCR仪 （MG96G型，杭州朗基科学仪器有限公司）、电泳仪（EPS-600 型，上海天能科技有限公司）、凝胶图像处理系统 （Tanon-4100,上海天能科技有限公司）、植物基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型，TIANGEN） Taq MasterMix （康为世 纪）、引物（上海Sangon公司）、5kDNA Marker （北京全式 金生物技术有限公司）、琼脂糖、EB （上海Sangon公司）， ABI 3730XL测序仪，其余试剂均为分析纯。 1. 3DNA的提取 选取硅胶干燥的植物叶片约20 mg,用 液氮研磨粉碎，使用试剂盒提取总DNA,具体步骤参照植物 基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，TIANGEN）的操作。 1.4 PCR扩增及产物测序 扩增ITS2序列正向引物 5 -GCGATACTTGGTGTGAAT-3r , 反 向 引 物 5’ -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-37。PCR 反应体积 50 uL, 引物各 1. 0 u L (2. 5 u mol ? L-l) (Sangon Co., 中国), 25 u L Taq MasterMix,总 DNA1 yL(约 20 ng),加 RNase-Free 水补足50 u L。引