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人皮肤鳞状细胞癌的细胞原代培养研究方法 王嘉月（山西长治医学院附属和济医院病理科 山西长治046000） 【摘要】目的探讨一种简便实用、成木低、纯度高并且成熟稳定的，体外培养 人皮肤鳞状细胞癌癌细胞及建立原代细胞系的方法,为皮肤癌的研究奠定实验基 础。方法 对20份皮肤鳞癌患者的新鲜手术标木，釆用组织块培养法和胶原酶消 化悬液培养法进行体外培养。通过直接观察、细胞形态学观察和免疫细胞化学方 法观察细胞的牛长情况、细胞形态学特征及鉴定所得到的癌细胞情况。结果3 份标木两种方法均培养出皮肤癌细胞，后者培养的细胞牛长速度快。结论应用组 织块和胶原酶消化法培养食管癌细胞，方法可行，适合推广应用。 【关键词】皮肤鳞状上皮癌细胞细胞培养细胞系 【中图分类号】R73-35+1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752 （2012） 20-0117-02 皮肤鳞癌（SSCC）是起源于皮肤角）］元细胞的一种恶性肿瘤，有时亦起源 于附属器，包括毛囊漏斗、皮脂腺导管或末端汗腺的角反细胞。SSCC在所有癌 中占很大比重，Ackerman统计占全部癌肿的第一位，国内胡正祥等⑴统计其占 第二位，我国各种皮肤癌发病率明显不同于西方国家，欧美统计皮肤癌中胞癌的 比例约鳞癌占20%,而基底细胞癌占80%。我国与某些亚洲国家的情况正好相反， 主要为鳞癌，鳞癌与基底细胞癌约为（5?10） : l［2］o SSCC的临床治疗以局部手术切除为主，辅以化疗，晚期肿瘤预后较差 是因其发牛深部浸润与远处转移。皮肤癌的发牛机制始终是研究的热点问题之一, 但目前尚未完全阐明［3］。体外分离、培养皮肤鳞癌细胞并建立细胞系，是研究皮 肤癌牛物学特性、癌变机理、指导治疗及判断预后必要的生物学模型。但皮肤癌 细胞系的建立比较困难，目前国内己建立的皮肤癌细胞系较少。多数方法或不稳 定可靠，或步骤复杂所用试剂昂贵，严重制约了后续的研究工作。木研究结合国内 外的一些培养方法，采用传统的组织块法在含有低浓度血清的复合培养基中体外 培养皮肤表皮细胞。以寻求一种适于推广的简便、快捷的方法，为体外进一步研 究正常上皮细胞的恶性转化及治疗方面，提供可靠的细胞来源。 1材料与方法 1.1主要仪器和材料 人皮肤鳞状细胞癌癌细胞取自长治医学院附属和平医院皮肤科，自 2009年10月?2010年10月皮肤鳞癌的手术标本20例。试剂购自于中杉公司。 1.2培养基制备 1.3皮肤鳞状上皮的取材及分离培养 以皮肤癌手术后3h以内的食管标本为材料。肉眼选取距肿瘤边缘3cm 以外的大约2cmtimes;3cm大小的皮肤组织，放入含有200U/ml青霉素、 200mg/ml链霉素的1640培养基中，立即带冋实验室。每次取材后,所取皮肤标本 均经病理证实为正常的皮肤鳞状上皮细胞，无不典型增生及肿瘤细胞。在无菌条 件下反复冲洗皮肤组织。置于1640培养基中,尽量剪除黏膜下血管和结缔组织， 将黏膜剪成2mm2大小的组织块。在25ml培养瓶底部涂布胎牛血清，并且放入温 箱中稍晾干，将剪好的黏膜贴于培养瓶内,黏膜面均朝上，每瓶9块,每个组织块间 相隔leg然后加入少量DMEM与F12混合(1 ： 1)培养基使组织块湿润，其后48h 内将瓶中的培养基加到2mL放入37°C、5%CO2的培养箱培养。以后每2?3天 换液一次。5天后开始有细胞从组织块边缘长出J4天后换液均去掉漂浮的组织 块。每个组织块所长出的上皮晕直径可有2?3cg4?5个组织块长出的细胞可以 覆盖培养瓶底。以后将组织块迁移到新的培养瓶中，按上述方法培养，组织块可以 被连续迁移数次，每次均有细胞长岀，状态良好生长稳定。同吋，使用1640培养基 应用上述方法进行皮肤上皮细胞的原代培养，观察培养细胞生长情况和状态。 1.4细胞学观察及鉴定 当有细胞从组织块边缘爬出后,以倒置相差显微镜观察活细胞形态，盖玻 片制作细胞爬片，常规HE染色,普通光学显微镜下观察细胞形态。透射电子显微 镜观察细胞超微结构。免疫组化方法鉴定细胞分子标记，使用角蛋白(CK)多克隆抗 体,按免疫组化试剂盒说明进行，普通光学显微镜下观察CK蛋白在细胞中的表达 情况,胞浆棕黄色表明细胞角蛋白阳性。 1.5细胞活力检测 活细胞直接观察、细胞计数法绘制细胞生长曲线、锥虫蓝活力鉴定参照 文献⑷。 2细胞学观察结果 2.1细胞培养情况 细胞培养情况 组织块培养法:组织块接种后第2天周边开始出现圆形透 亮的细胞，第7天开始周边爬出上皮细胞贴壁生长，第10天开始上皮晕逐渐向外周 扩大，细胞单层紧密镶嵌排列，呈多角形，到第20天上皮晕融合成片，给予首次传代。 此后每4?6天传代1次。胶原酶消化法:悬液接种后第2天大部分细胞已贴壁， 细胞聚集成团散在分布，第5天细胞团块周边开始爬出细胞,形成上皮晕后细胞紧 密镶嵌排列，