利用细胞吸附态和内态Cu分离技术探究三角褐指藻吸收利用Cu机制.docxVIP

利用细胞吸附态和内态Cu分离技术探究三 角褐指藻吸收利用Cu机制 【摘要】溶解态铜(Cu)在水体中以络合态与游离 态的形式存在，通过吸附以及吸收等方式进入藻细胞，从而 影响其生长和生理代谢。然而，受研究方法限制，我们对藻 类吸收利用Cu机制仍不十分清楚。本文在添加了系列浓度 Cu的培养基中培养三角褐指藻，采用了 一种草酸清洗以分离 细胞壁上吸附态与内态Cu的方法，来研究不同铜浓度的条 件下，藻类吸收利用Cu的过程。结果表明：由于EDTA的存 在，培养基中的Cu大部分以络合态形式存在，游离态Cu2+ 浓度很低，但是，微量的Cu2+对藻的生长代谢也有一定影响; 随着培养基中Cu2+的增加，细胞吸附态Cu显著增加，而内 态Cu有少量增加，反映了生物的自我保护机制。通过模拟, 藻细胞吸附与吸收Cu的方程为：y吸附二exp (0. 58*ln (x) -0. 22), R2=0. 97, y 吸收二exp (0. 57*ln (x) - 1. 68), R2=0.94o 【关键词】铜；吸附吸收机制；草酸洗液；三角褐指藻 1?前言 近年来，含Cu等重金属的工农业废水、城市生活污水 以及采矿废水等向水体大量排放，使水体环境中Cu含量显 著增加[1, 2]o Cu对生物体扮演双重角色，低浓度时参与新 陈代谢反应［2］,但超过一定的阈值则对生物体有毒性作用 ［3］。除了用总溶解态Cu来指示其对生物的影响外，Cu在水 体中的存在形态也是很重要的指标：溶解态Cu大部分以络 合态的形式存在，游离态Cu2+在水体中含量很少，当被吸收 至细胞内时，会影响生物的生长生理代谢［4］。先前有很多 针对水体中高浓度Cu与藻相互作用的报导［5, 6］,但对于 微量Cu2+的存在条件下，藻细胞如何吸收Cu的研究较少。 目前用于研究生物吸收吸附金属的方法尚有不足，因此需要 建立一种新的方法来做更深入的探索。 三角褐指藻(Phaeodactylum triconutum)属于硅藻门, 羽纹纲，褐指藻目，褐指藻属。近岸水体发生藻华时，硅藻 常常是优势种，而三角褐指藻的分布范围较广且易于在实验 室内进行培养，因此常被用来作为海洋浮游生物毒性测试的 实验材料。本文用添加了不同浓度Cu的培养基对三角褐指 藻进行培养，利用草酸洗液清洗的技术高效分离出细胞内态 的Cu和细胞壁上吸附的Cu,对藻细胞吸附吸收Cu的机制进 行探讨。 2.材料与方法 2. 1实验材料 三角 褐指藻 (Phaeodactylum triconutum Bohlin), strain CCMA 106,于2004年在南海中分离，由厦门大学近 海海洋环境科学国家重点实验室的海洋微型生物保种中心 获取。培养基由过滤后的南海表层海水(Seats站：116° E, 18° N)添加Aqu订溶液［7］制得。藻在正式应用于实验之前, 培养20个世代，温度维持于20 土 0.5 °C,用冷白色荧光 灯管照明，光强为140 ?mol photons, m-2. s-1,光暗周期比 是12 : 12 ho添加生长良好的指数生长期的藻液于培养基内 进行培养。 2.2实验方法 2. 2. 1培养 实验所用培养液与器皿均经高温灭菌消毒。实验采用 Nalgene 4L圆柱形瓶，在GXZ智能型光照培养箱(宁波江南 制造厂，中国)内2(TC恒温培养，光照强度为140 P mol ? m-2 - s-1,光暗周期比为12 : 12 ho培养基中加入CuS04的 浓度依次为：0 u mol ? L-1, 0. 25 u mol ? L-l, 0. 5 u mol ?LT, 1. 0 P mol ? L-l, 2. 0 P mol ? L-l, 4. 0 P mol -L-l, 8.0 nmol - L-l, 16.0 nmol - L-l,每个浓度设 3个平行样。在上述的浓度下，三角褐指藻的初始接种密度 为85000 cells ? mLT,经过72h的培养后取样处理测定。 2. 2.2细胞内金属以及细胞吸附态金属的区分和测定 实验采用Tovar-Sanchez等在2003年报导的使用草酸 洗液清洗藻细胞的方法来区分细胞壁上吸附的以及细胞内 的Cu［8］。该方法的原理为：细胞壁上吸附有铁氧化物，Cu 等金属会吸附在这些铁氧化物上，当添加草酸洗液时，其主 要成分草酸溶液会和细胞壁上的铁氧化物发生氧化还原反 应，进而洗去吸附在细胞壁上的金属。同时草酸洗液中也添 加了 EDTA以及柠檬酸盐等具有螯合性的试剂，提高了去除 吸附态金属的效率。该方法可以去除97%的吸附态金属，且 不会导致细胞裂解。草酸洗液还具有稳定性强，便于在实验 室中操作的特点，因此可以用来高效的区分细胞内部以及细 胞壁上吸附的金属。 培养72 h后，将样品拿至100级的洁净室内，