基于构建仿生细胞微环境物和柔性亚基修饰的酶固定化研究.docVIP

基于构建仿生细胞微环境物和柔性亚基修饰的酶固定化研究 ● ‘● ● ● ● 一 ● ?■ ■‘ ●一 :. 乏学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得南京工业大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名: 匿』』墼 日期:狸: 学位论文的使用声明 、南京工业大学、国家图书馆、中国科学技术信息研究所、万方数据电子 出版社、中国学术期刊光盘版电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复 印件和电子文档,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文并通过网络向社 会提供信息服务。论文的公布包括刊登授权南京工业大学研究生部办理。打 钩生效 口、本论文已经通过保密申请,请保留三年后按照第一项公开打钩生效 口、本论文已经通过校军工保密申请,不予公开打钩生效 聊躲 研究生躲困丛 避 日 期: 日 鲨:博士学位论文 摘要 酶在从细胞环境提取和纯化过程中,亚基解离等结构变性造成催化活性损失 和稳定性下降,制约其在工业生物催化中的广泛应用。因此,提高胞外酶的催化 性能和反复回用的稳定性是国际生物催化领域研究的热点。传统的酶固定化在选 择功能化载体与纯化酶催化剂技术方面研究较为集中,对酶与固载物之间的微环 境的创建及提高酶对环境适应性的研究尚欠深入。酶组装进载体后,易增加底物 在孔道中的传质阻力,导致催化过程中酶与底物结合的能力下降。因此,增加酶 对底物的亲和力,减少催化反应体系的传质阻力,提高固定化酶的表观催化活性, 并提高酶催化剂的环境适应性和稳定性,以降低生产成本显得非常必要。 本课题以青霉素酰化酶与胰蛋白酶为研究对象,基于构建仿生细胞微环境和 稳定酶的亚基的研究思路,应用硅烷化载体组装酶,并对固定化酶进行化 学修饰研究。结合载体的硅烷化制备、生物相容性大分子的拥挤效应、醛基化大 分子的后交联修饰策略,构建了适合不同酶种的固定化酶微环境,并与载体内纳 米孔道共同提供酶催化的适宜传质通道。添加生物亲水性大分子作为修饰保护 剂,而醛基化大分子的共价后修饰稳定了酶的亚基构型,提高了固定化酶的表观 催化活力、稳定性和固定化酶对环境的适应能力,并将醛基化修饰的固定化青霉 素酰化酶和胰蛋白酶用于酶法催化合成医药中间体.氨基青霉烷酸和胸腺五肽 前体二肽.觚..的过程中。本论文的主要研究结果如下: 通过研究两种目标酶在介孔载体中的固定化,考察了不同条件下 的催化性能,结果表明:在青霉素酰化酶的固定化过程中,氨基为最适载 体,加酶量为 载体,固定化时间 ,负载率为.%,固定化酶 / 的相对活力高达.%,湿酶活力为. /:胰蛋白酶的固定过程中,羟基 为最适合的载体,固定时间为 ,加酶量为 /,值为.,固定化 酶的绝对活力为. /,最适催化温度为℃。 模拟孔道内细胞的拥挤环境,研究了大分子试剂的亲和吸附修饰对青 霉素酰化酶和胰蛋白酶负载率、催化性能和稳定性的影响。亲和大分子的共组装 提高了固定化青霉素酰化酶与胰蛋白酶的表观催化活力,负载率超过%。大分 子试剂添加量为%/时,修饰的青霉素酰化酶催化活力为. /摘要 提高至.倍,修饰固定化酶的表观活力为. /以湿重计。 修饰的固定化胰蛋白酶,催化活力提高为.倍,表观活力达. /以干载 体计。通过甘氨酸封闭,青霉素酰化酶 残余活力为.%提高至未封闭时 的.倍。封闭存贮周后,:乖修饰的固定化青霉素酰化酶保持.% 和.%的残余活力,远高于未修饰的固定化酶及游离酶.%和.%。固 定化青霉素酰化酶和胰蛋白酶的最适催化值均向中性方向偏移,最适催化温 度均提高.℃,酶与底物的亲和性明显提高。 醛基化大分子共价修饰固定化酶,在给酶蛋白创造仿生细胞内的催化 环境的同时,可加强酶的亚基间的稳定交联,增强固定化酶的机械强度。对醛基 化修饰的固定化酶进行了表征检测,通过红外检测发现醛基的特征红外光谱吸收 峰,通过.电泳检测出逐渐淡化的亚基解离谱带,通过紫外全波长扫描 处有强吸收峰,通过热失重分析以及氮气吸附/解吸附实验对 得到的 固定化酶制剂孔道性能进行考察。根据所有的表征数据推断:大分子被成功地醛 基化修饰并与固定化酶共价组装,且此醛基化修饰策略稳固了固定化酶的亚基。 醛基化修饰构建最适催化微环境,提高酶活和负载率%。醛基化修饰 后,固定化青霉素酰化酶表观催化活力为. /。胰蛋白酶表观催化活力为 . /。醛基化修饰能稳定固定化酶的亚基,避免其在操作过程中脱落,能 有效维系酶的刚性。醛基化修饰后青霉素酰化酶的最适催化值范围和偏酸 环境的耐