鸭源肠球菌的致病性和致病机制的研究.docVIP

鸭源砀球菌的细跑壁蛋白鉴定和致病性的关系的研究 摘要 以临床分离的４株鸭源肠球菌（郑１株、郑２株、郑３株、北京株）和１株粪 肠球菌（参考株）为研究对象，根据其部分生物学特性将各菌株鉴定到种；人工感 染雏鸭及小自鼠，比较各菌株的致病力强弱，探讨肠球菌的致病特点和致病机制； 提取各菌株的细胞壁蛋白，制备抗原、抗体，并采用ＳＤＳ，ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ技 术比较各菌株细胞壁蛋白的异同。借以对分离菌株进行更细致的表型分析，探讨肠 球菌的胞壁蛋白的差异性与其致病力强弱之间是否存在着关联，从而为该病的致病 机制和免疫机制的更深入研究提供理论依据。 １．对４株鸭源肠球菌临床分离株和ｌ株粪肠球菌参考菌株的形态特征、培养特 性、生理生化特性、对药物的敏感性等生物学特性进行了初步研究，旨在将这４株 临床分离菌株准确鉴定到种，为以后的致病性试验和不同菌株细胞壁蛋白的比较分 析奠定基础。结果５个被检菌株在光学显微镜下呈球形、革兰氏阳性染色和链状排 列方式，以及能在１０℃、４５℃和６．５％ＮａＣｌ肉汤等条件下生长的特性均符合肠球菌 属的特征，各菌株生化反应特性与粪肠球菌特性基本一致，因此将这５个菌株均鉴 定为粪肠球菌。药敏试验结果发现它们均对青霉素、万古霉素和庆大霉素敏感而对 四环素耐药。＋ ２．复制雏鸭感染肠球菌病理模型，观察各组鸭感染后的主要临床症状和病理变 化，计算各组感染鸭的发病率、死亡率和细菌分离率；同时测定各菌株对小白鼠的 半数致死量，观察感染小鼠的主要临床症状和病理变化。旨在比较不同菌株的致病 力强弱，找出高致病力菌株，揭示肠球菌的致病特点和致病机制。结果显示５个菌 株对雏鸭和小白鼠均有致病性，且以北京株致病力最强，其感染雏鸭的发病率、死 亡率和细菌分离率均明显高于另外４株；北京组感染鸭早于其它组出现临床症状且 症状最明显，病理变化也较其它组严重；北京株对小白鼠的ＬＤ５０明显低于其它４株， 对感染小鼠的病理损伤也较其它组严重。感染鸭主要剖检变化为心包积液，心外膜 和气囊表面附着有纤维素性炎性渗出物，肝脏肿大、淤血、出血和坏死，以及脾脏 肿大等；镜下主要发现病鸭心肌出卧嘌仔韵赴笠约捌⒃嗔馨拖赴跎俚?等。 ３．将各菌株的１８ｈ ＴＨＢ培养物离心，沉淀用溶菌酶处理后经超声波粉碎菌体细 胞，再将裂解物离心，取沉淀得细胞壁制备物。该细胞壁制备物再经７０％饱和硫酸 铵纯化即得细胞壁蛋白。采用ＳＤＳ．ＰＡＧＥ技术分离各菌株的细胞壁蛋白，比较各菌 株蛋白图谱的异同。采用半干转印系统将ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分离的各抗原蛋白带转印到 ＰＶＤＦ膜上，与常规方法免疫家兔制备的抗北京株胞壁蛋白的抗血清进行Ｗｅｓｔｅｒｎ． ｂｌｏｔ分折，柃测各抗原蛋白的免疫学活性。结果各菌株的细绝壁蛋白经ＳＤＳ．ＰＡＧＥ 在分子量３３ｋＤ～１３２ｋＤ之间均显示十多条蛋白带；而用抗北京株胞壁蛋白血清作 华中农业大学２００６届硕￡论文Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ来检测各菌株的胞壁蛋白，则只能识别出北京株的抗原蛋白带而识别不出其它４个蘸株的蛋白带，且北京株所碱测到的蛋白中以６７ｋＤ的蛋白带显色最清晰。 关键词：鸭；肠球菌；鉴定；致病性；ＳＤＳ．ＰＡＧＥ；胞壁蛋白： Ⅱ 鸭原肠球菌的细胞壁蛋白鉴定和致病性的关系的研究 Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｙｉｎｇ ｄｕｃｋｓ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ ａｎｄ Ｈｕｂｅｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｉｎ ２０００～２００４ ａｎｄ ｏｎｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆＥ ｆａｃｉａｌｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｄｕｃｋｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂＶ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ， ＳＯ ａｓ ｔｏ ｖｅｒｉｆｙ ｉｆ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｏｍｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．ｗｈｉｃｈ ｗｏｕｌｄ ｏｆｆｅｒ ｓｏｍｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｍｕ