二色补血草l来bgst基因的克隆与功能研究.docxVIP

摘要摘要 摘要 摘要 植物谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferases)家族在植物逆境反应和牛长发 育过程中都起着非常重要的作用。本研究从二色补血草cDNA文库中分离出一条谷胱甘 肽硫转移酶基因，将其命名为肋GST(FJ620899)。该基因eDNA全长987 bp，其中5’ 端含非编码区29 bp，3’端含非编码区307 bp，开放阅读框全长651 bp，共编码216个氨 基酸，该基因编码蛋白的分子量为24．5 kDa，理论等电点为5．98，为酸性蛋白。氨基酸 序列分析表明，LbGST蛋白与其他植物GST的同源性较低。 采用实时荧光定量RT-PCR技术研究不同胁迫条件下，￡6傩丁基因在二色补血草中 的表达模式。结果表明，三6砸丁能够应答NaCl、NaHC03、PEG6000以及低温胁迫。亚 细胞定位结果表明，LbGST-GFP蛋白分布在细胞核内。 构建原核表达质粒pGEX-4T-2．LbGST，将其转入大肠杆菌BL21中。利用0．1 mmol／L的IPTG诱导该基因在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS．PAGE检测结果显示， 重组表达载体的大肠杆菌在50 kDa处出现了特异的融合蛋白，与预期结果一致，证明 了GST与LbGST融合蛋白的表达。 将LbGS德因构建到酵母表达载体pYES2qb，形成鼋组质粒pYES2．LbGST，将其转 入酿酒酵母INVScl中验证LbGS磔_．因在不同非生物胁迫下的抗逆能力。结果表明工6GS丁 基因对多种胁迫(NaCl、NaHC03、低温、PEG、高温和紫外线)具有耐受能力。 为进一步验证￡6GS瑾因在盐胁迫下的功能，将其转入烟草中。随机选取5个转基 因株系进行NaCl胁迫试验，分析逆境胁迫条件下非转基因烟草和转基因烟草的谷胱甘肽 硫转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物 酶(POD)、过氧化氢酶(CAr)活性，丙二醛(MDA)、脯氨酸以及Na+、K+离子含量 等指标的变化。结果显示，盐胁迫下多数转基因烟草的GST、GPX、SOD、POD、CAT 酶活性以及脯氨酸含量高于非转基因烟草，而MDA含量比非转基因烟草低。另外， 肋回礴因的过量表达扰乱了转基因烟草对于K+的吸收，但有效地抑制了转基因烟草对 Na+的吸收，使得转基因烟草在盐胁迫条件下始终保持较低水平的Na+。这些结果说明， LbGS瑾因的过量表达可能减少了过氧化反应以及膜受损害程度，提高和保护了其他一 些与活性氧清除相关酶的活性，从而增强了植物的抗逆能力。 关键词二色补血草；谷胱甘肽转移酶；非生物胁迫；耐盐能力 AbstractAbstract Abstract Abstract Plant glutathione S-transferases(GSTs)play an important role in plant stress responses and growth development．In the present study,a novel GST gene，designated LbGST(GenBank number FJ620899)，WaS cloned from Limonium bicolor(Bunge)Kuntze(Plumbaginaceae)． The full-length eDNA sequence of LbGST is 987 bp in length,including 29 bp of the 5’ untranslated region and 307 bp of the 3’untranslated region．The open reading flame(ORF)is 65 1 bp in length,encoding a deduced amino acid sequence of 2 1 6 residues with a molecular weight of 24．5 kDa and an isoelectric point of 5．98．Mutiple sequenc alignment analysis suggested that the homology between LbGST and other GSTs from other plants was low． the expression pattern of LbGST in response to abiotic stress WaS researched by using real．time RT-PCR．The results suggested that￡6(嚣丁Call response to the treatments o