二甲基精氨酸九二甲胺水解酶2重组蛋白纯化及功能分析.docxVIP

摘要研究背景和目的心血管疾病是严重危害人类健康的常见病。一氧化 摘要 研究背景和目的心血管疾病是严重危害人类健康的常见病。一氧化 氮介导的内皮依赖性血管舒张反应降低是大多数心血管疾病的早期病理 表现。大量研究表明，内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物一非对称性二 甲基精氨酸(ADMA)是导致血管内皮功能不全的重要物质。二甲基精氨 酸二甲胺水解酶(DDAH)是内源性ADMA的主要代谢酶。已知DDAH 存在两种亚型——DDAHl和DDAH2；前者主要分布于表达神经型NOS 的组织，后者则主要分布于表达内皮型NOS的心血管组织；因此，DDAH2 是决定心血管系统ADMA含量的关键因素。但目前尚无直接增加DDAH2 表达和活性的药物。近年来发现一种来源于人类免疫缺陷病毒HIV．1 Tat (Trans．activator transcription)蛋白的蛋白功能区，称之为PTD区段 (Protein transduction domain)，能有效地引导肽段或蛋白质进入细胞， 具有蛋白传送功能。因此，本课题将Tat PTD区段融合于人DDAH2蛋白 的N端，使DDAH2蛋白具备穿膜能力，定位于细胞内并发挥作用。在此 基础上，用多种心血管的危险因子如高糖、同型半胱氨酸、游离脂肪酸如 棕榈酸处理培养的人脐静脉内皮细胞系(HUVEC．12)，观察上述因素对 细胞内DDAHl和DDAH2表达及DDAH活性的影响：并进一步探讨外源 性给予Tat．hDDAH2蛋白能否直接增加细胞中DDAH2蛋白含量，抵抗上 述因素对DDAH活性的抑制，从而为大规模开发可应用的重组蛋白产品 奠定技术基础，为心血管疾病防治拓开新途径。另一方面，用重组的 DDAH2融合蛋白作为抗原，制备家兔来源的抗血清，用于DDAH2表达 的检测。 方法①构建重组pGEX．6p．1．Tat．hDDAH2原核表达载体：以我室 以前构建pcDNA3．1．hDDAH2质粒为模板，用Tat．hDDAH2上下游引物扩 增Tat．hDDAH2基因，重组到T载体上，构建pGEM．Tat．hDDAH2质粒， 然后再分别用Sal I和BamH I双酶切pGEM．Tat．hDDAH2和原核表达载 体pGEX．6p．1，连接重组成pGEX．6p．1．Tat．hDDAH2载体；再转化到宿主 大肠杆菌BL21体内诱导表达，并通过优化诱导条件提高目的基因的原核 表达水平和可溶性融合蛋白的含量。②重组Tat．hDDAH蛋白的纯化：将 包涵体形式的重组蛋白溶于8 mol／L的尿素溶液中，然后经过复性、透析 得到复性蛋白GST-Tat．hDDAH；再将从细菌裂解液上清中的可溶性 GST-Tat．hDDAH蛋白和从包涵体中得到的复性蛋白与还原型谷胱甘肽琼 GST-Tat．hDDAH蛋白和从包涵体中得到的复性蛋白与还原型谷胱甘肽琼 脂糖珠(Glutathione Sepharose 4B)充分混匀，经过Glutathione Sepharose 4B的亲和吸附得到纯化的GST-Tat．hDDAH2融合蛋白，最后经过 PreScission蛋白酶切，获得重组的Tat．hDDAH2蛋白。③抗hDDAH2抗 血清的制备：重组pGEX．6p．1．hDDAH2载体；一再转化到宿主细菌体内进 行诱导表达，得到大量含GST．hDDAH2蛋白的包涵体；经2％的脱氧胆酸 钠溶液洗涤后得到较纯化的包涵体，并将其作为抗原与佐剂充分乳化后经 皮下注射免疫新西兰大白兔，制备抗DDAH2的多克隆抗体，并用ELISA、 western blot检测DDAH2抗体的滴度和特异性，用于后续实验中DDAH2 蛋白表达的检测。④重组Tat．hDDAH2蛋白的功能实验：培养人脐静脉 内皮细胞系HUVEC．12，分别用心血管疾病的危险因子高糖、同型半胱氨 酸、游离脂肪酸如棕榈酸(palmitic acid，PA)孵育HUVEC．12 16～48 h， 检测这些危险因子对内皮细胞DDAHl和DDAH2蛋白表达和DDAH活性 的影响；并观察Tat．hDDAH2蛋白能否逆转上述因素对DDAH活性的损 害。 结 果 ① 经PCR、酶切及测序鉴定，原核表达载体 pGEX-6p—l—Tat-hDDAH2(Fig．1~3)和pGEX一6p·1一hDDAH2(Fig．4)构 建成功；并转化BL21大肠杆菌诱导表达，通过筛选不同的诱导条件，发 现用较低的IPTG浓度(O．05 mM)在低温(250c)环境下和适当地延长 诱导时间(8 h)有利于可溶性融合蛋白GST-Tat．hDDAH2(Fig．5～7)和 GST-hDDAH2(Fig．9～11)在细菌体内的表达，但在原核细胞中仍以不 溶性的包涵体为主：将包涵体变性、复性后，再经纯化和PreScission蛋白 酶酶切，最后获得