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甘蓝型油菜GRAS家族基因B，b■鼬q分离和功能分析摘要 甘蓝型油菜GRAS家族基因B，b■鼬q分离和功能分析 摘要 GRAS转录因子作为植物特有的转录因子家族，在植物的生长发育及信号传 导途径具有重要作用。但目前在油菜乃至整个芸苔属中对GRAS家族基因的研 究还很少。拟南芥以S基因是GI认S基因家族的成员之一，在植物的腋生分生组 织的分化中具有重要地位。为深入了解甘蓝型油菜中GRAS类基因的作用，本研 究在克隆芸苔属三个种“S同源基因的基础上，通过分析过表达甘蓝型油菜 B碰4S基因的转化拟南芥，对占删S的功能进行了初步分析，重点研究了B碰么S 基因在提高植物抗旱性的作用，主要结果如下。 利用拟南芥以S核昔酸序列设计引物，以甘蓝型油菜华双5号基因组DNA 为模板进行PcR扩增获得召以4S基因的DNA片段。通过TAII，．PCR技术分离 到其两侧序列，最终获得全长为1326bp的B，删S基因序列，同时分离到了B碰4S 基因上游1944bp的启动子序列。生物信息学分析表明，占碰么S基因属于GRAS 家族成员，Southem杂交显示B删S基因在甘蓝型油菜中可能存在2个拷贝。 荧光定量PCR和GUS染色分析表明，B，删S基因在植物的根部表达最强， 其次为花蕾、花、茎顶端。而在腋芽，叶片和茎中仅仅在荧光定量PCR中可以 观察到微弱的表达信号。 将B以么S基因在CaMV35S启动子驱动下，转化到拟南芥植株中进行过量表 达分析。结果显示，与野生型拟南芥植株比较，过表达B删S对植株形态以及 生长发育都有明显影响。过表达植物表现出生长速度延缓、叶绿素含量增加、花 期延迟、育性降低等一系列变化。 将转基因植株和野生型植株在等生物量条件下进行抗旱处理15天后，当野 生型植物发生萎蔫时，转基因植株生长仍然较为正常。将三种类型植物(野生型 植株，b突变体，过表达家系植株OLl4和OLl8)种植在同一钵环境条件下进 行旱胁迫处理，经过15天处理后，过量表达植株存活率分别为71．9％(OLl4)和 91．6％(0L18)，而野生型植株和-as突变体植株的存活率分别只为21．9％和11％。 离体叶片的失水速率检测结果也表明，转基因植株的叶片离体失水速率显著低于 野生型植株。 由于过表达植株的根部没有观察到显著的变异，而离体叶片的失水速率减 华中农业大学2010届博士学位论文缓，暗示过表达植株抗旱性的提高可能和叶片结构变化有着直接的关系。扫描电 华中农业大学2010届博士学位论文 缓，暗示过表达植株抗旱性的提高可能和叶片结构变化有着直接的关系。扫描电 镜和光学显微镜观察发现，过表达植株OLl8叶片表皮细胞减小，总气孔数目增加 1．7—1．9倍。尽管过表达植株和野生型植株间的开放气孔数目差异不明显，但过 表达植株的气孔开度只有野生型植株的18％一40％。 在利用扫描电镜观测到转基因植株叶表面蜡质层增厚的基础上，对几个蜡质 合成关键基因在转基因植物中的表达进行了荧光定量PCR分析。蜡质合成关键 基因C隙J、C肷2、KCS，、KC铭等四个基因的表达量在转基因植株中显著上升， 表明过表达B，删S基因影响了叶片表面的蜡质合成。通过叶绿素浸出实验进一 步证实了蜡质层的加厚导致了角质层渗透性改变。 综上所述，在拟南芥中过表达B，删S基因对其生长发育有明显影响，转化 植株的抗旱性明显增加，而这种抗旱性的增加主要是叶片表面结构改变所致。 关键词：甘蓝型油菜；GRAS转录因子；抗旱；气孔发育；蜡质 n 甘蓝型油菜GI认S家族基因B，!L4S的分离和功能分析Abstract 甘蓝型油菜GI认S家族基因B，!L4S的分离和功能分析 Abstract GRAS proteins as a unique由mscnption factor f．amily t0 plants were inv01ved in tbe伊owth and deVelopment and sigllal mmsduction pathways．So f．ar there haVe been Ve巧f．ew stu碰es on the劬ctions of GRAS proteins in B麟s纪傩阳．Arabid叩sis以S a member of t11e GRAS f．amily，has an iInportant role in me础tiation of aXilla巧 meristems．To study the缸lction of GRAS family in Bm站fc口忍印淞，锄J6她bidopsis L4S homologous gene was cloned in tllree Bmssica species．The B碰么S gene f．unction was analyzedⅡlrou