甘蓝型油菜紫叶基因b前naa.pl1定位和候选基因分析.docx

华中农业人学2015届博土研究生学位(毕业)论文2．2试验方法 华中农业人学2015届博土研究生学位(毕业)论文 2．2试验方法 ．．24 2．2．1遗传群体的构建 24 2．2．2紫叶性状植物学表型观察及花色苷显微定位 25 2．2．3叶绿素的提取和比较 25 2．2．4花色苷的提取和比较 26 2，2．5紫叶性状对光合作用的影响 26 2．2．6分子标记方法 28 2．2．7 AFLP多态性标记的T-A克隆 30 2．2．8 SNP：芭：片结合BSA法开发标记 ．31 2．2．9分子标记的开发 32 2．2．10连锁图的构建 ．32 2．2．1 1半定量和定量PCR 32 2．2．12 BnaA．儿，序列分析 34 2．2．13转录组测序分析 ．34 3结果与分析 ．39 3．1 6—1029全生育期紫叶性状观察 ．．39 3,2紫叶突变体叶片观察及花色苷组织定位 一40 3．3叶绿素和花色苷含量的比较 一4l 3．4紫叶性状对光合作用的影响 ．．42 3．4．1光响应曲线分析 42 3．4．2 C02响应曲线分析 44 3．5紫叶遗传规律确定 一47 3．6紫叶基因BnaA．PLl的定位 48 3．6．1 SSR及AFLP标记的筛选 48 3．6．2 SNP芯片多态性标记的筛选 50 3．6．3其它紫叶基因连锁标记的筛选 53 3．6．4 BnaA．PLl基因的遗传定位 ．54 3．7半定量和定量PCR ．58 3．7．1半定量PCR ．．58 II 万方数据 蓝型油菜紫叶BnaA 蓝型油菜紫叶BnaA PLl基因定位及候选基因分析 3．7．2定量PCR 59 3．8候选基因在突变体和野生型之问的比较测序与分析 ．60 3．9紫叶突变体的转录组分析 ．63 3．9．1测序数据质量评估 ．．63 3．9．2 Reads与参考基因组比对 64 3．9．3 RNA—seq整体质量评估 一64 3．9．4 6—1029中与拟南芥花色苷合成基因同源基因的差异表达分析 ．．72 4讨论 ．．83 4．1白菜基因组与甘蓝型油菜A染色体组的共线性 83 4．2 SNP结合BSA在甘蓝型油菜定位的优势 83 4．3 BnaA．PLl是不同于Bra017728和Bra017831的基因 84 4．4花色苷合成与硫代谢的关系 84 4．5紫叶突变体在育种中应用 ．86 4．6下一步计划 ．87 参考文献 89 致谢 ．100 附录l 一102 附录2 ．．103 IlI 万方数据 甘蓝型油菜紫叶BnaA．PLI基网定位及候选基因分析摘要 甘蓝型油菜紫叶BnaA．PLI基网定位及候选基因分析 摘要 甘蓝型油菜紫叶性状是由于花色苷在叶片中的积累所产生的形态学变异。紫叶 除可作为一种重要的指示性状运用于杂交制种外，其所富含的花色苷具有光保护、 耐干旱、耐寒、减少病虫害以及抗氧化、抗肿瘤、改善心血管等诸多的生物学保健 功能。正因如此，与花色苷相关的性状成为近年来的研究热点之一。 本研究对甘蓝型油菜紫叶突变体(6．1029)进行了如r卜．研究：(1)全生育期表 型观察、花色苷分布的解剖学观察；(2)利用紫叶突变体与绿叶野生型(6—1025) 建立了定位群体和近等基因系(NIL)；(3)分析了6．1029、6．1025及其F1花色苷含 量著异以及NIL中3种叶色(紫叶、浅紫叶、绿叶)单株叶绿素、花色苷含量、光 合作用特性；(4)在利用定位群体分析紫叶性状遗传模式的基础上，依据公布的甘 蓝型油菜和白菜基因组数据库对紫叶基因进行了精细定位；(5)在确定同源的甘蓝 型油菜和白菜候选区段后，进行了候选基因预测、候选基因表达量分析、候选基因 比较测序以及NIL中3种叶色单株的转录组测序及花色苷相关基因表达量分析。本 研究的结论如下： 1 6-1029全生育期叶色形态学观察 通过对6．1029全生育期的叶色形态学观察发现，6．1029的子叶在初生时呈绿色， 6天后开始显浅紫色；6—1029的真叶在初生时呈绿色，生成3天后叶脉处开始显浅 紫色；随着生长时间的延长，6—1029叶片紫色逐渐加深，第35天开始呈现典型的紫 色性状；自抽薹期开始，6．1029叶片紫色开始变淡，至终花期完全恢复绿色。从上 述结果来看，6—1029的紫叶性状与其所处生长发育时期有关。 2 6．1029花色苷分布的解剖学观察 对6—1029和6。1025及两者杂交后代Fl叶片的显微观察发现，6．1029和F1叶片 上表皮细胞均有花色苷分布，但Fl叶片中花色苷的密度要低于6—1029：6—1025叶片 则没有花色苷分布。此结果与表型观察相符，即6—1029叶片正而呈紫色、F，叶片正 面呈浅紫色、6．1025叶片为绿色。 万方数据 华中农业大学2015届博士研究生学位(毕业)论文3叶绿素和花色苷含