丙胺酸立体异构物与L.ppt

若欲定序整條多肽，最常被使用的化學性方法，是由 Pehr Edman 所開發出來的。 艾德曼降解法（Edman degradation）只會對胜肽之胺基端殘基加以標定並移除之，其餘所有肽鍵仍均保持完整（圖3-25b）。 目前艾德曼降解法可在一種稱為蛋白質定序儀（sequenator） 上進行，機器會將各步驟所需試劑以正確比例確實混勻、分離且決定產物，並記錄結果。 利用艾德曼降解法準確定序之多肽長度是由每個個別化學步驟的效率決定的。 p.97 p.97 圖3-25 大分子蛋白質須先經片段化後始能完成定序 胺基酸定序之效率通常隨著多肽長度增加而遞減。 蛋白質中非常長的多肽必須先打斷成小片段後才能有效地進行定序。 蛋白質會先以化學或酵素方法切割成數個特定的片段。如果有雙硫鍵存在，必須先將其打開。 每個片段都需分別純化後再以艾德曼降解法進行定序。最後，各片段出現在原始蛋白質中之順序將排列好，並決定出雙硫鍵所在之位置。 p.98 打斷雙硫鍵 雙硫鍵的存在會干擾定序的進行。 雙硫鍵也會干擾多肽以化學或酵素方法切割的過程。兩種將雙硫鍵不可逆打斷的方法如圖 3-26 所示。 p.98 FIGURE 1-13 p.98 圖3-26 FIGURE 1-13 p.98 圖3-26　打斷蛋白質中之雙硫鍵。圖中所示為兩種常用的方法：以過氧甲酸處理可將胱胺酸氧化成兩個磺基丙胺酸殘基；以二硫蘇糖醇處理則可將胱胺酸還原成兩個半胱胺酸殘基，再進一步以碘乙酸將反應性強的游離硫醇基進行乙基化反應，以避免其再次氧化回復形成雙硫鍵構造。 圖3-26 切割多肽鏈 有幾種方法可用來片段化一條多肽鏈。 蛋白酶（proteases）可催化肽鍵之水解切割，有些蛋白酶只切割連接在特定胺基酸殘基旁之肽鍵（表 3-7），因此其切割產物之片段是可預測且具再現性的。 胰蛋白酶切割產生的小片段數目可用以推測蛋白質中 Lys 與 Arg 殘基的個數；這個數值可以與直接將蛋白質水解所得到之個數互相對照（圖 3-27）。 p.98 表 3-7 p.99 p.99 圖3-27 FIGURE 1-13 p.99 圖3-27　切割蛋白質、定序及胜肽片段排序。首先決定出蛋白質樣品之胺基酸組成及其胺基端殘基。緊接著將可能有的雙硫鍵還原，以使定序有效進行。在此例中，蛋白質分子僅有二個半胱胺酸殘基，因此只有一對可能之雙硫鍵形成位置。當多胜肽含有三個或以上的半胱胺酸殘基時，則必須考慮更多可能之組合方式產生雙硫鍵之位置，而檢驗方法請參閱內文敘述。（胺基酸單一字母代號請參照表 3-1。） 圖3-27 胜肽定序 每條由胰蛋白酶切割產生之胜肽片段均以艾德曼法分別定序之。 胜肽片段排序 重疊序列的出現有助於我們了解胜肽片段的正確排列順序。如果胺基端殘基在蛋白酶切割前就已得知，則能協助我們判斷胺基端片段序列為何。 雙硫鍵的定位 如果蛋白質一級結構中有雙硫鍵存在，則它們會在定序完成後，以另一個步驟來決定。 p.100 BOX 1-2 FIGURE 1 p.101 BOX 3-2 以質譜分析法研究蛋白質 圖1　蛋白質的電子噴霧質譜分析法。(a) 蛋白質溶液在高電壓電場作用下通過針頭而分散成帶多電荷之液滴。液滴蒸發後添加了大量質子之離子態樣品進入質譜儀進行質荷比（m/z）測量。 BOX 1-2 FIGURE 1 p.101 BOX 3-2 以質譜分析法研究蛋白質(續) 圖1　蛋白質的電子噴霧質譜分析法。 (b) 所產生之光譜由一群波峰組成，連續性波峰中每個峰值（由右至左）與相鄰峰值之質量與電荷差異均為 1（以 1遞增）。另由電腦運算所得之光譜轉換則如內插圖所示。 BOX 1-2 FIGURE 1 p.103 BOX 3-2 以質譜分析法研究蛋白質(續) 圖2　利用串聯質譜分析法取得蛋白質序列資訊。(a) 蛋白質水解之後，將樣品溶液注入第一個質譜儀（MS-1）。將不同的胜肽分類，使只有一種選定的胜肽進行後續分析。選定之胜肽會在兩質譜儀間之碰撞槽進一步片段化，之後每個片段的質荷比會在 MS-2 中測定出來。在這第二次片段化所得到的許多離子是由肽鍵斷裂產生的（如圖所示），它們也稱為 b-型或 y-型離子，其分辨取決於電荷是留在胺基端或羧基端上。 BOX 1-2 FIGURE 1 p.103 BOX 3-2 以質譜分析法研究蛋白質(續) 圖2　利用串聯質譜分析法取得蛋白質序列資訊。 (b) 一個典型的具有 10 個胺基酸殘基之小胜肽經質譜分析所得之結果。圖譜中的各個峰值分別代表不同大小的胜肽片段。在此所標示的峰值為 y-型離子，靠近 y5〞的大波峰是一個帶兩價的離子，並不屬於 y-型離子。連續性峰值彼此