利用伴刀豆球蛋白A测定谷物直链淀粉的方法.docVIP

利用伴刀豆球蛋白A测定谷物直链淀粉的方法 伴刀豆球蛋白：植物凝集素，与多糖具高度亲和性的一种植物糖蛋白。 Introfuction 常用的直链淀粉测定方法有电势计法、安培法及I2与直链淀粉结合力的比色法。然而，这些方法存在不确定性。因为支链淀粉与I2也形成复合物，在非比色法中，减少了游离I2的浓度；在比色法中，可能与直链淀粉-的I2复合物有相似的波长，导致直链淀粉的过高估计，因此需要修正。不准确也可来自标准曲线只描述直链淀粉，而没有说明支链- I2复合物的吸收；或由于直链淀粉标样的来源不同产生的影响。而且，直链- I2复合物的最大波长随聚合度的增加而增加。虽然直链淀粉I2结合法迅速、简便，但不适于各种来源淀粉的测定。其它测定直链淀粉的方法，如分馏或酶解后的色谱法，适于精细结构的研究，不适于大样品。其它如近红外透射、发射光谱、扫描热量法，虽然迅速，但需要校准的参照方法。现已证实，伴刀豆球蛋白A只与支链淀粉复合，而不与直链淀粉结合。 Materials 除DMSO外，都为分析试剂级。伴刀豆球蛋白A为Sigma（＃L-7647）的V1型，或来自Megazyme的直/支链淀粉分析套件。淀粉葡萄糖苷酶（对p-硝基苯基β-麦芽苷200U/mL 或对可溶性淀粉3260 U/mL，在pH4.5 40℃）和α淀粉酶（1000 U/mL）由爱尔兰Megazyme公司以50％稳定甘油溶液和硫酸铵沉淀的形式提供。 注：爱尔兰Megazyme公司全淀粉分析套件：α淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖测定试剂（也称GOPOD试剂，由葡萄糖氧化酶/过氧化酶和4-氨基安替比林组成）和葡萄糖标准液。 Enzyme assays Reagent Preparation 浓缩的Con A 试剂制备按Yun and Matheson的方法。1升溶液含无水醋酸钠(49·2 g), NaCl (175·5 g), CaCl2.2H2O (0·5 g), MgCl2.6H2O (0·7 g) and MnCl2.4H2O (0·7 g)，逐滴加入50％（v/v）醋酸调pH为6.4。此步必须小心，pH值调过此值会导致沉淀，即使pH调准后也不会再融解。此现象发生后溶液必须报废。浓缩液在室温下稳定，使用时，30mL浓缩液用蒸馏水稀释到100mL，用于制备3.0mg/mL的Con A溶液。α淀粉酶/淀粉葡萄糖苷酶试剂也在开始使用时配制：0.1mLα淀粉酶和0.1mL淀粉葡萄糖苷酶用pH5.0的0.2M的醋酸钠缓冲液稀释到20mL。Megazyme淀粉分析套件的葡萄糖标准液（1.0mg/mL）直接使用。pH4.5和pH5.0的0.2M的醋酸钠缓冲液通过稀释醋酸和2M NaOH制备。 Procedure 预处理和分散：谷物籽粒磨碎后过0.5mm的筛。面粉和淀粉可直接分析。20-25mg样品（精确到0.1mg）置入10mL具塞试管，加1mLDMSO，低速涡旋分散。加盖后置沸水浴1min，取出高速涡旋振荡，再沸水浴15min（间歇振荡）。在样品分散时，避免溅到内壁上。如果15min后还有凝胶块，继续振荡、加热，直到完全分散。然后脱脂，试管从热水中取出，加4.0mL 95％乙醇，高速涡旋振荡，沉淀样品，沉淀过程中，避免淀粉聚合。再加2mL乙醇，上下翻转，使悬浮液混匀。室温下15min，2000g离心5min收集沉淀，倒掉上清夜，置吸水纸10min沥干水分。再加1mL DMSO轻微振荡混合悬浮，在沸水浴15min间歇振荡分散。若此时凝胶块依然明显，样品报废。 2mL稀释后的Con A溶液与样品液混合，并用Con A定容到25mL，直链淀粉的分析在60min内进行，以避免直链淀粉可能的分解，此溶液为A液。1mLDMSO用Con A定容到25mL作为空白。 直链淀粉的测定：0.75mLA液转移到2mL的微量离心管，加0.75mL的Con A，反复翻转混匀（允许在室温下60min），20000g离心10min，1mL上清夜转到10mL离心管中，用1mL 0.2M pH4.5的醋酸缓冲液混合，用玻璃塞盖好，沸水浴5min，使Con A变性，并在40℃水浴保温补偿5min，加1mL的α淀粉酶/淀粉葡萄糖苷酶试剂，混匀，40℃30min，2000g离心5min。双份1mL上清夜用4mL GOPOD混合，40℃保温20min，以试剂空白做对照，510nm比色。100ug/mL的葡萄糖标准液（0.15mL加0.85mL H2O）的吸光度也同时在510nm测定。 总淀粉的测定：0.25mL溶液A用2.0mL 0.2M pH5.0的醋酸缓冲液和1mL的α淀粉酶/淀粉葡萄糖苷酶试剂混于10mL离心管，40℃保温30min，冷却到室温，1mL等分试样用4mL GOPOD混匀，40℃保温，510nm比色按上面描述的进行。