姜黄素诱导结肠癌LoVo细胞凋亡作用和机制探究.docxVIP

姜黄素诱导结肠癌LoVo细胞凋亡作用和机 制探究 ［摘要］目的：探讨姜黄素促人结肠癌LoVo细胞 凋亡的生物学作用及其调控机制。方法：体外培养人结肠癌 LoVo细胞，0?20mg?L-1不同浓度姜黄素处理后，采用MTT 比色法测定姜黄素对细胞的增殖抑制作用，利用透射电镜观 察细胞的超微结构，采用PI单标流式细胞仪测定细胞周期 分布，Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率；采用 RT-PCR 检测 Bax, Bcl-2, Caspase-3, Bcl-xL mRNA 表达水 平。结果：MTT检测显示姜黄素能显著抑制人结肠癌LoVo细 胞的生长、增殖，呈现浓度和时间效应关系；透射电镜结果 显示姜黄素能使LoVo细胞发生形态学改变，呈现典型凋亡 细胞特征；流式细胞仪分析显示姜黄素能阻滞细胞周期于S 期，诱导细胞发生凋亡。RT-PCR检测显示姜黄素可促进细胞 中 Bax, Caspase-3 mRNA 表达，抑制 Bcl-2, Bcl-xL mRNA 表 达。结论：姜黄素能显著抑制人结肠癌LoVo细胞的增殖并 促进其凋亡，这种生物学效应可能与激活Bax表达、抑制 Bcl-2和Bcl-xL表达而活化Caspase-3的信号通路有关。 ［关键词］姜黄素；结肠癌；LoVo；细胞凋亡 结肠癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤。随着人们 生活习惯和饮食结构的改变，我国结肠癌的发病率呈逐年上 升趋势。除了传统的手术、放疗与化疗外，由于天然药物的 多成分、多靶点、多环节、多途径效应，使人们认识到‘回 归大自然”的重要性，植物源化合物的抗肿瘤研究已逐步成 为临床抗肿瘤药物研究的热点。 姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提取的一种天然多 酚，为姜黄的主要活性成分。在亚洲一些国家，姜黄素一直 被广泛地用作治疗炎症、哮喘、肝功能紊乱等疾病的药物、 食品着色剂和调味剂。此外，姜黄素还在许多肿瘤细胞中发 挥着抗炎，抗氧化，抗肿瘤和化学预防作用［1-2］。许多体 内外实验也证实姜黄素能抑制肿瘤生长，显著减少瘤体的数 目，减轻多种致癌因素对机体的损害［3-5］。由于姜黄素的 药理作用十分广泛，其抗癌作用机制较为复杂，目前仍未完 全阐明。本研究拟探讨姜黄素对结肠癌细胞株LoVo的增殖 抑制和凋亡诱导作用机制，为进一步阐明姜黄素的抗肿瘤机 制提供更多的实验依据。 1材料 1. 1药物及试剂姜黄素(C1386-10 g, Sigma公司进口 分装，临用时以少量DMS0溶解，再加培养液稀释至所需浓 度，其中DMS0的终浓度 2.2透射电镜观察细胞超微 结构 用0?20 mg?L-1梯度浓度的姜黄素作用LoVo细胞24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化离心，以0.01 mol ? L-l PBS (pH 7. 3)清洗2遍，1 000 r?minT离心，收集细胞，迅 速加入 3%戊二醛固定 3 ho 用 0. 01 mol ? L-l PBS (pH 7. 3) 浸洗3次，加2%琼脂使细胞成团凝固，于1%饿酸中固定2 h。 再用0. 01 mol ? L-l PBS (pH 7. 3)充分浸洗2次，梯度丙 酮(50%?100%)逐级脱水，进入氧化丙烯。环氧树脂Epon812 逐步浸透、包埋，最后在Epon812中于60 °C下聚合48 h。 超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬铅双染后，透射电子显 微镜下进行观察。 2. 3 PI单标法检测细胞周期 将0?20 mg?L-l梯度浓 度姜黄素处理24 h的LoVo细胞消化离心，收集各组细胞， 用 0. 01 mol ? L-l PBS (pH 7. 3)轻洗 2 次；1 000 r ? min-1 离心5 min,弃上清，加入2 niL盐水G,吹打悬浮细胞，缓 慢加入6 mL预冷的95%乙醇，冰浴30 min, 4 °C固定4 h； 1 000 r ? min-1离心固定的细胞5 min,弃上清，加入0. 01 mol ? L-l PBS (pH 7. 3) 6 mL 混匀,1 000 r ? min-1 离心 5 min,弃上清；加入 1. 5 mL 0. 01 mol ? L-l PBS (pH 7. 3) 吹打均匀，重悬细胞，再加入1.5 mL的PI染液，避光染色 30 min后，以1X106个/mL上样流式细胞仪，检测细胞周 期分布。 2. 4 Annexin V-FITC和PI双标检测细胞凋亡 将0?20 mg?L-l梯度浓度姜黄素处理24 h的LoVo细胞消化离心， 收集各组细胞，用0. 01 mol ? L-l PBS (pH 7. 3)轻洗2次; 1 000 r ? min-1离心5 min,弃上清，用500 n L IX膜联 蛋白结合缓冲液重悬细胞，加入5 nL Annexin V- FITC避 光染色