试验四PCR扩增目的基因.ppt

5. PCR反应常见问题 1. 没有任何产物： 模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂） 酶失活或者忘记添加 引物设计，浓度 Mg2+浓度太低 变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等 2. 产生多个条带： 引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高 Mg2+浓度太高 酶用量太多 退火温度过低等 3.产生与目的片段长度相似的非目的片段: 模板或者试剂不纯，有其他基因组污染 4. 出现片状拖带： 模板，酶，dNTP用量太大，循环次数过多 实验四 PCR扩增目的基因 【PCR 原理】 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。 反应包括: 变性(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。 这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。 加热 变 性 复性 复温 DNA的变性和复性 加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 PCR扩增原理 延伸 变性、退火 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 变性 退火 3’ 5’ 延伸 变性：加热，使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 退火：溶液温度降至45～65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3’-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按5’－3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。 PCR的三个热反应过程 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 PCR的产量 每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。 DNA产量以指数上升，n个循环后，达到2n拷贝。 【仪器耗材与试剂】 （一）仪器与耗材 1. PCR热循环仪 2. 20μL、 200μL 吸头，200μL、500μL EP管，10μL、 50μL、200μL移液器 3. PCR 电泳仪和电泳槽 （二）试剂 10×PCR Buffer； MgCl2, 25 mmol/L； dNTP（ 其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP；每种浓度均为10 mmol/L ）； 正向引物与反向引物（10 μM/L）； Taq DNA聚合酶（1U/μL）； DNA模板 （小鼠基因组DNA，100ng/μL ， 反转录cDNA）； ddH2O 【实验步骤】 1. 在0.2 mL Eppendorff 管内配置20 μL反应体系： 反应物 体积（μL） dd H2O 12 PCR缓冲液 （10×） 2 MgCl2 （25 mmol/L） 2 dNTP （10 mmol/L ） 1.0 正向引物 （ 10 μM/L ） 0.5 反向引物 （ 10 μM/L ） 0.5 Taq DNA聚合酶 1 模板DNA 1 2. 按下述程序进行PCR扩增: 1） 94℃ 预变性 3 min； 2） 94℃ 变性 1 min； 3） 55℃ 退火 30 sec； 4） 72℃ 延伸 30 sec； 5） 重复步骤2~4, 34次； 6） 72℃ 延伸 5 min； 7） 4 ℃, 3min. 3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 配制2％琼脂糖凝胶，取10 μL扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。 4. PCR的反应体系中各组分作用 DNA 模板 (template) 引物 (primer) 4种脱氧核苷酸 （dNTP） DNA聚合酶 （Taq） 反应缓冲液 Mg2+及某些使酶稳定的辅剂 质量：要求有较高纯度的DNA样品 避免反复冻融，防止降解 数量: 25-10