第十四章免疫细胞的分离与检测.pptVIP

September 1999 免疫细胞的种类 淋巴细胞：T细胞、B细胞、NK细胞等 单核－巨噬细胞 树突状细胞 粒细胞 分离免疫细胞的样本来源 外周血 脾脏 淋巴结 胸腺 骨髓 分离免疫细胞的目的 检测免疫细胞的数量和功能，观察机体免疫状态 免疫细胞的细胞生物学研究 免疫细胞的培养和建株 分离免疫细胞的一般原理 物理学和生物学特征 密度大小 表面标志 其它活性：吞噬、黏附等 本章主要内容 1. 免疫细胞的分离与纯化 第一节 免疫细胞的分离与纯化 白细胞的分离 外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞和单核细胞的分离与纯化 淋巴细胞亚群的分离 细胞活力的检测 一、白细胞的分离 细胞密度不同，沉降速度不一样。 粒细胞1.092, 红细胞1.093, 沉降速度不一样。 自然沉降法(血浆、白细胞、红细胞) 聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。 (会增加白细胞的黏性) 二、外周血单个核细胞的分离 外周血细胞的密度 血小板：1.030-1.035 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 粒细胞：1.092 红细胞：1.093 聚蔗糖（Ficoll）－泛影葡胺分层液法 （一）原理和方法 3. 离心分离：将细胞叠加在密度合适的分层液(1.075-1.09) 上层，经离心后细胞可分为不同的区带。 （二）方法评价 是分离PBMC最常用的方法 操作简单，不需特殊仪器设备 分离纯度高，可达95％ 细胞得率高，可达80％ 三、淋巴细胞和单核细胞的分离 （一）红细胞的去除：低渗0.83％NH4Cl处理 单核细胞的去除 黏附去除法：根据单核细胞具有黏附作用而去除（培养；凝胶柱） 羰基铁粉法：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力（Ficoll离心；磁铁） 粘附贴壁法 单核细胞－－贴壁生长 玻璃、塑料平皿/培养瓶、37℃、1h 取未贴壁细胞------淋巴细胞（T、B） 刮下贴壁细胞------纯单核细胞 缺点：B细胞也有较弱贴壁，使B细胞收率↓ 过柱吸附法 层析过柱，单核细胞滞留于层析柱中 洗脱------淋巴细胞 层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶 粘附能力：Mф、Mon＞DC ＞BC ＞ TC=RBC Percoll分层液法 Percoll分层液：经聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒、无刺激。 Percoll原液加PBS稀释，高速离心（21000g）连续密度梯度。 淋巴细胞亚群的分离 E花环分离法 尼龙棉柱分离法 方法评价： 实验室常用分离方法之一 简便、易行 获得细胞纯度较高 T细胞90％ B细胞80％ 尼龙毛柱法＋E花环法，T细胞可达99％以上 （三）补体细胞毒法 原理：免疫细胞表面的某种Ag与相应Ab结合，加入补体，借助补体介导的细胞毒作用，破坏Ag阳性的细胞，收集Ag阴性的细胞。 亲和板分离法 （五）免疫磁珠法 原理： 将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB） 分法： 直接法 间接法 MACS法（magnetic activated cell stoter） 评价 高纯度（95％～99％） 高回收率（90％～95％） 高活性（99％～100％） 效果可与流式细胞仪媲美， 但更经济、省时、简便、快速 流式细胞仪（FCM）具有高速、 高纯度、高精度优势。 细胞分选 细胞分选（cell sorting）：有选择地从一个混合细胞群体中分离出某一类特定细胞的技术。 四、吞噬细胞的分离 吞噬细胞种类 3ml肝素抗凝全血＋1/4体积6％右旋糖酐生理盐水，室温静置30－40min，取上层白细胞，0.8％NH4Cl溶解红细胞，离心，取细胞沉淀用Ficoll－Hypaque分离液分离中性粒细胞和单个核细胞。 五、细胞活力检测 细胞活力：指细胞存活的数量，一般用百分表示。 通常活力应＞95% 方法：苔盼蓝染色法 活细胞：不着色 死细胞：着色 第二节 淋巴细胞的数量检测 2. 免疫组织化学法： 酶标：ABC，APAAP 金标法 3. 微量细胞毒试验 微量细胞毒试验 (三) 可溶性抗原肽-MHC四聚体复合物法 是一项近年发展起来的新技术 与FCM联合, 定量检测抗原特异性T淋巴细胞 第三节 淋巴细胞功能检测 T细胞功能检测 B细胞功能检测 NK细胞活性测定 一、T细胞功能检测 Produce cytokines Cytotoxic action Mediate DTH T细胞功能检测试验 T细胞增