欧洲药典EP60-2612微生物限度.docVIP

2.6.12非无菌产品的微生物限度检查（总的需氧菌菌落计数） 本章包括两种检验方法。第一种方法给出的是测定适用性的参考方法。因些在一个专论中依照本法就意味着依从第一种方法，除非特别指出要使用第二种方法。第二种方法也是欧洲药典的官方组成部分，并且值得注意的是第二种方法特别适用于销售认可。一旦该相关专论被修订就意味着将用第二种方法替代第一种方法。第二种方法包含日本药典和美国药典的共同部分使其能够协调。 A．欧洲药典方法 该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。 设计该试验的最初目的是以审疑的态度为了测定一种物质按照欧洲药典的检测方法是否符合微生物的特定限定要求。如果是以这种目的来测定的话，根据下述方法，包括所需的样品数和按照下面方法来解释结果。该法也用来测定药典所描述的抗菌保留的有效性（5.1.3）。此外，该法也可以用来监测原料质量同时也可以用来作为微生物质量检测的指导方针（5.1.4）。如果是用来指导以下目的，如生产厂家的原料检测和/或终产品的检测或终点判定，则包括所需样品数和结果解释的试验方法就必须在生产厂家和主管当局之间达成一致。执行该方法所设计的实验条件就必须避免所测产品受到意外污染。避免污染所采取的措施不侧够影响任何所测的微生物。如果所测产品有抗菌活性，则该产品活性必须补充分中和掉。如果因为该种目的使用灭活剂则必须证明该灭活剂对微生物的有效性和无毒性。 测定总的需氧微生物数通过微孔滤膜法或专论中所描述的平板菌落计数法。 当没有其它方法可以釆用来测定细菌数时保留最大可能数（Most Probable Number, MPN）.选择哪种应该根据产品的特性和可预计的微生物数等因素来选择。任何选择的方法必须通过合理的验证。 当根据5.1.3或5.1.4使用时，可以使用平板浇注法和表面扩散法，和微孔滤膜法。 样品制备： 抽样检验方法：所选样品必须遵循抽样样品规则。抽样检验的结果依赖于下列因素：如样品批号，不可接受的高污染产品的健康危害，产品特性，可预料的污染程度等。除了特别说明外，取10g或10ml物质或制剂检测，釆取上面提到的预防措施。从大批样品中随机选择样品或从制剂容器中随机抽取。如有必要，为了获得所需的样品，将容器中大量的内容物混匀以保证每一份样品都能包含在内，是否要这样做依赖于所检测物质或制剂的性质。现举例说明适用于产品的抽样检验方法，而在该法中关于微生物分布状态的同质性方面可能存在问题，该例包括三类抽样检验方法。在该例中有从每批中分别抽取五份样品。以下是三种方法： （i）可接受的样本：例如：样品包括不少于m CFU(菌落数)/g or ml, m 代表在相关专论中特定指出的限度。 （ii）边缘样本：例如：大于m CFU 而小于10m CFU/g or ml. （iii）有缺陷的样本：例如：包含大于10m CFU/g or ml. 水溶性产品：溶解或稀释10g 或10ml待测产品于氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液剧烈振荡至少30分钟（得制备液A）或另一种合适的液体中。一般来说要准备好1/10的稀释液。但是，根据产品特性或所需的敏感性可以考虑其它比例的溶液。如果产品有抗菌活性，必须添加灭活剂到稀释液中。如有必要，调节pH到大约7，并准备一系列10倍的稀释液用于样品稀释。 不溶于水的非脂溶性产品：将10g 或10ml待测产品悬浮于氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液或另一种合适的液体中。一般来说要准备好1/10的稀释液，但根据一些产品特性或所需的敏感性需要更大体积的液体。可以添加合适的表面活性剂如1g 聚山梨醇酯80来帮助不易润湿的底物悬浮液稳定。如果产品有抗菌活性，必须添加灭活剂到稀释液中。如有必要，调节pH到大约7，并准备一系列10倍的稀释液用于样品稀释。 脂溶性产品：取10g 或10ml待测产品与不多于一半质量的灭菌聚山梨醇酯80或另一种灭菌表面活性剂混匀，如有必要可加热，但不超过40℃，如有例外情况下也不应高于45℃。仔细混匀，如有必要可以维持温度在水浴中或恒温器中。加充足的预热过的氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液制成一倍或10倍原产品的稀释液。仔细混匀同时维持温度使其能在最短时间内形成乳液状，但无论如何不要超过30分钟。此外必须准备一系列10倍氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液包含有合适浓度的灭菌聚山梨醇酯80或其它灭菌表面活性剂。 贴剂：用无菌镊子除去10批贴剂的表面保护膜（“线性释放”），将它们平放，粘性表面向上放于无菌玻璃或塑料皿中。如有必要，粘性表面用无菌纱布（或纤维聚合物过滤膜）覆盖，然后转移这10批到最少500ML的氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液中，该溶液添加有适当的灭活性如聚山梨醇酯80和/或卵磷酯。剧烈振荡至少30分钟（得制备液A）。用同样的方法准备另10批样品，