免疫细胞分离技术.ppt

细胞免疫学检测讲课教师 季育华 第一节 免疫细胞分离技术 人外周血(peripheral blood )白细胞分离 一、原理(principle)： 红细胞/白细胞比例不同（600～1000）：1，密度不同，沉降速度不同。 二、方法(method)： 1、自然沉降法 （直立静置RT30～60min，紧贴红细胞层上的白膜层） 2、聚合物加速沉降法 （加某些高分子物使RBC凝集成串加速沉降，如明胶） 人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的分离 聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque) 人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation) 人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★ 淋巴细胞亚群的分离 分离依据： 1、淋巴细胞不同亚群其细胞表面标志（ specific membrane molecule/surface marker） 2、淋巴细胞不同亚群其细胞分化抗原（antigen of cluster differentiation ；CD） 分离方法： 1、 Precipitation of E rosette Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor. Lymphocytes + sRBC , centrifugation----- T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面） 2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附着～ （例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞～ （例）1、亲和板结合分离 (affinity ～) 2、免疫磁珠分离 （immunomagnetic beads） 3、流式细胞术分离 (FCM) 磁性微珠(magnetic beads): 正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞 负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞 一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大 评价(evalution)： ①免疫磁珠分离法具有高纯度（80?99％），高得率（90?95％）、高细胞活性（99~100%）的特点，仅次或相当于流式细胞仪（FACS）的分选效率。 ②与FACS 相比，本方法操作简单、省时、经济；可用做FACS分选前的预分离，以减少FACS所用时间。 ③另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达95－99％。 注意事项（Attentions） 如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。 分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。 抗体包被磁珠和死细胞常有非特异性结合，因而分选前应去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞，打散细胞团块。 用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞 荧光激活细胞分离仪原理(principle)（fluorescence activated cell sorter，FACS） 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区。 当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴，每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞）。 细胞经激光照射产生荧光和散射光，信号经计算机系统处理，分辨细胞的类型。如识别的是所需的细胞时（如T细胞），使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管。  评价(evalution) ： ①用FACS分离细胞准确快速、纯度高、回收率高，能保持细胞活力，并可在无菌条件