配子及胚胎冷冻保存、胚胎移植、性别控制.ppt

第五部分 胚胎生物技术四、配子与胚胎冷冻保存五、胚胎移植六、性别控制 配子与胚胎冷冻保存 概念：配子与胚胎冷冻是指采用抗冻保护剂对配子或胚胎进行脱水处理，再经过降温程序使胚胎最终在-196℃条件下停止代谢活动，条件适宜时解冻并使其恢复活力的技术。 意义：建立配子库、胚胎库；保护生物多样性和珍惜濒危动物遗传资源；遗传资源及动物模型的国际范围内运输；避免运输过程中携带细菌或病毒。 原理： 细胞代谢活动与温度 脱水过程 抗冻保护剂 冰晶与抗冻保护剂毒性/渗透压打击之间的平衡 细胞代谢活动与温度： 配子及胚胎的自身活力和代谢活动直接受温度变化的影响，当处于超低温（-196摄氏度）时，代谢活动完全停止，处于静止状态，当在适宜条件下温度升高后又可以恢复活性。 脱水过程： 配子或胚胎冷冻保存事实上是一个脱水过程，当配子或胚胎处于高渗溶液中，细胞内的水分通过细胞膜外流，当环境渗透压足够大或胚胎暴露时间足够长时，细胞内的水分充分外流，从而在冷冻过程中避免或减少冰晶的形成。 抗冻保护剂： 通常在冷冻液中添加抗冻保护剂形成高渗，细胞内水分外流的同时，抗冻保护剂内流至配子或胚胎细胞内，抗冻剂存在使溶液的冰点降低，使胚胎有更多的时间把细胞内的水分脱出，避免形成冰晶。但抗冻剂具有毒性，尤其在高浓度和高温情况下毒性更大。 冰晶与抗冻保护剂毒性/渗透压打击之间的平衡： 冷冻过程中除了冰晶、抗冻剂毒性外，还要考虑渗透压打击。因此冷冻成功与否就在于在冰晶和抗冻剂毒性和渗透压打击之间的平衡点。抗冻保护剂浓度越高、处理时间越长脱水越彻底，但毒性和渗透压打击越大。 抗冻保护剂的种类： 1、小分子渗透性抗冻保护剂 甘油、乙二醇、丙二醇、DMSO等 2、大分子非渗透性抗冻保护剂 蔗糖、聚蔗糖、棉子糖，麦芽糖，海藻糖等 3、卵黄（sperm） 一、精液冷冻： 小分子渗透冷冻保护剂（甘油）+卵黄，液氮蒸气熏蒸或干冰冷冻 精液冷冻步骤： 采精 精液品质检查 精液的稀释 精液保存 （一）、采精： 定义：借助特定的器械将雄性的精液采集出来的技术。 （一）假阴道法 Artificial vagina （牛、羊） （二）手握法和筒握法 A gloved hand （猪） （三）按摩法采精 Massage method （犬、鸡） （四）电刺激采精法 Electroejaculation（野生动物和丧失交配能力但种用价值高的公畜） （二）精液品质鉴定： 1、外观： 颜色： 一般为乳白色或灰白色。正常牛羊精液呈乳白色或乳黄色，猪、马的精液呈淡乳白色或浅灰白色。 2、性状：云雾状 浓份精液因精子密度大、活力强，使精液翻腾 呈现旋涡云雾状。 3、pH值： 牛、羊精液pH值为6.5-6.9, 猪、马为 7.4-7.5。 一般同种精液pH值较低的品质较好。 4、杂质： 如被毛、脱落上皮、炎性分泌物、灰尘、纤丝。 5、精子活率检查 精子活率：在显微镜下观察，在一个视野内向 直线前进运动的精子占全部精子总数的百分率。 ?一般在37-38°C温度下进行评定，牛、羊精液尚需 用生理盐水作稀释后才能评定。 ?活力一般用0-1.0的10级评分，一般新鲜采精液活率 应该为0.7~0.8左右。 6、精子密度的检查 精子密度：是指单位体积（ml）精液内所含有的精子数。 目测：在低倍显微镜下根据精子之间的距离来定，分为密、中和稀三等。 7、精子的形态检查 精子畸形率：头部、颈部、尾部，观察200个精子， 求出比例。用于输精的精子畸形率不得超过20%。 头部：巨大，细小，缺失，双头，轮廓不明显，皱缩 颈部：臌大，纤细，弯曲，不全，原生质滴 尾部：屈折，带原生质滴，双尾，折断，纤细 8、精子顶体异常率 顶体与精子受精能力直接有关，牛超过14%，猪超过4.3%，显著降低受精率。 (三)、精液稀释液 细管? A．一液：2.9％柠檬酸钠液100.0mL，卵黄10.0mL。 ???????????? 二液：取一液41.75mL加果糖2.5g，甘油7.0mL。 ????????? B．脱脂牛奶83.0mL，卵黄10.0mL，甘油7.0mL。 ??? 颗粒? A．12.0％蔗糖液75.0mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。 ????????? B．0.11％乳糖液75mL，卵黄20.0mL，