核酸的结构和性质教学课件.ppt

3.2? 核酸的酸碱性质 磷酸和碱基均能发生两性解离。 DNA等电点 4～4.5 RNA等电点 2～2.5 1、碱基的解离 P504 2、核苷的解离 P505 3、核苷酸的解离 核苷酸的解离曲线 pK1? = 0.9 第一磷酸基 pK3? = 6.2 第二磷酸基 pK2? = 3.7 含氮环 腺嘌呤核苷酸 pK1? = 0.7 第一磷酸基 pK3? = 6.1 第二磷酸基 pK2? = 3.7 含氮环 烯醇式羟基 鸟嘌呤核苷酸 pK1? = 0.8 第一磷酸基 pK3? = 6.3 第二磷酸基 pK2? = 4.3 含氮环 胞嘧啶核苷酸 pK1? = 1.0 第一磷酸基 pK3? = 6.4 第二磷酸基 烯醇式羟基 尿嘧啶核苷酸 pH 离子化程度 小牛胸腺DNA的滴定曲线 pH 3.3 核酸的紫外吸收 碱基、核苷、核苷酸和核酸在240～290nm的紫外波段有强烈的光吸收，λmax= 260nm 1、鉴定纯度 纯DNA：A260/A280 = 1.8（1.65-1.85） 纯RNA：A260/A280 = 2.0 若溶液中含杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 2、含量计算 1 A260值相当于：50ug/mL双链DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应） A260的应用 增色效应：DNA变性时, 紫外吸收A260值增高的现象。 减色效应：DNA复性时, 紫外吸收A260值降低的现象。 3.4 核酸的变性、复性及杂交 3.4.1 变性(denaturation) 核酸变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。 ＤＮＡ分子的变性 ★变性因素： 热变性 酸碱变性(pH4或11) 变性剂(尿素/盐酸胍/甲醛) ★变性后的理化性质： A260升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。 Hyperchromic effect 增色效应 ★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 解链温度(melting temperature, Tm): DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性(单链)，A260= 1.37。当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在82～95℃之间。 影响DNA的Tm值的因素 ①DNA均一性。 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性。 ②G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。 G-C% =（Tm-69.3）×2.44 影响DNA的Tm值的因素 ③介质中离子强度。离子强度高，Tm高。 影响DNA的Tm值的因素 3.4.2 复性(renaturation) 变性DNA在适当条件下，两条分开的链重新缔合成双螺旋结构。 ★热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，此过程称为退火(annealing)。 ★DNA片段越大,复性越慢 ★DNA浓度越大,复性越快 DNA浓度与复性时间的关系 T1/2 × C ＝ const ●单一核苷酸对(A=U)，若浓度为Co=1.0mmol/L，则 50%复性时， Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒 全部复性， Cot=10-4， t=0.1秒 ●E.coli 4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，则 复性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天。 复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5×108秒，5758天。 ●根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数 ★复性速度可用Co·t衡量。 Co为变性DNA原始浓度(mol·L-1)，t为时间(s)。 Cot1/2为复性一半的Cot值。 Cot曲线 3.4.3 分子杂交(hybridization) 分子杂交的原理示意图 不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区,称核酸分子杂交。 制备特定的探针(probe)通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。 实例：southern印迹法 DNA-DNA 杂交双链分子 (heteroduplex) 变性 复性 不同来源的DNA分子 DNA-DNA杂交示意图 DNA-RNA杂交示意图 1、Southern Blotting DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 → 固定 →