培养细胞性状的生物学检测.ppt

2. 免疫酶技术：最常用的免疫细胞化学技术。 【原理】用酶标记已知抗体或抗原，通过加入酶的作用底物进行显色，以检测细胞内或组织标本中相应的抗原或抗体的方法。 用于标记的酶主要为过氧化物酶（HRP），与显色底物DAB（二氨基联苯胺）发生化学反应呈棕褐色。 * 【方法】常用的免疫酶技术包括直接法、间接法、PAP法、双PAP法以及ABC法等。 * * 过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP）（3个酶分子+2个抗酶抗体） 抗酶抗体与一抗同源。灵敏，背景染色低。 * 卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法） 比PAP灵敏、背景染色低 * 碱性磷酸酶（ALP）-抗碱性磷酸酶复合物（APAAP） * 多聚鳌和物法 * 【特点】 ①??普通光镜即可检测，易于检测、推广。 ②??对比度好，染色标本可长期保存 ③??可进行复染如HE染色，因此可将免疫组化结果与形态特征相结合进行分析。 ④ 不仅可用光镜观察，且能用于超微结构的研究。 【注意事项】 ①设立阳性和阴性对照，以排除非特异性染色。 ②抗体最佳稀释度的选择。 ③整个染色过程中标本不能干燥。 ④注意每步彻底清洗细胞涂片或组织切片。 ⑤显色时间的控制。 * * 三、原位杂交 【原理】用已知序列的特定标记的核酸作为探针，与细胞涂片或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法称为核酸原位杂交。 * 【特点】 应用广泛，如可对染色体中特定DNA序列精确定位、RNA杂交可观察组织细胞中特定基因的表达水平等。 不需从组织细胞中提取核酸，对组织细胞中含量极低的靶序列有极高的敏感性。 可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映细胞的功能关系。 能在复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，尤其适于那些细胞数量少且散在于其它组织中的细胞内DNA或RNA的研究。 * 【标记物】 放射性标记：32P、3H、35S、14C、125I、131I等，敏感性高，方法简便，操作稳定。 非放射性标记：地高辛、生物素、荧光素等，安全、无放射性污染、稳定性好、显色快、易于观察。 * * 制备双层软琼脂培养检测克隆形成率模式图 * 软琼脂克隆培养 * 软琼脂培养法克隆形成率的影响因素： ? 细胞性质：如原代培养和传代培养，正常细胞和肿瘤细胞。（克隆形成率反映细胞的群体依赖性和增殖能力）  ?接种细胞的密度：细胞密度不能太大，以免细胞克隆界限不清(接种细胞密度不应超过35个/cm2) 。 ? 其他因素：如温度、pH、营养成分、底物等。 ? 细胞状态：一定要处于半对数生长期。注意： ①?细胞小群中的细胞数不应小于20个。 ② 一定形成单细胞悬液。 ③细胞密度不能太大，以免细胞克隆界限不清。 ④选用指数生长期的细胞。 6. 流式细胞仪（Flow cytometer, FCM）检 测细胞周期 * 细胞周期：由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。 ① G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到DNA复制之前的间隙时间； ② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期； ③ G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间； ④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。 原理： 流式细胞术分析细胞周期是依据细胞DNA含量进行分析。 细胞固定后用PI （Propidium iodide碘化丙啶），染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。 PI不能透过完整细胞膜，染色前需将细胞固定。 * * 方法： 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，PBS洗涤两次。 将细胞重新悬浮在500μl PBS中，避免形成细胞团块，加入预冷的75%乙醇（1-2×106/ml），于4℃固定过夜。染色之前细胞在4℃固定可保存至3周。 离心弃固定液，加3ml PBS重悬细胞沉淀。 300目筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃PBS。 加RNase至终浓度100 μg/ml ，37℃作用30min后,加PI染液至终浓度50 μg/ml，4℃避光30min。 流式细胞仪检测，488nm检测荧光。 * 结果 * 细胞周期 G2 M G0 G1 s 200 400 600 800 10