生物化学实验2幻灯片.ppt

DNS-氨基酸的分离和鉴定： 1．溶剂系统 第Ⅰ相展层溶剂系统（1）：甲酸（88%）∶水=1.5∶100（V/V） 第Ⅱ相展层溶剂系统（2）：苯∶冰乙酸=9∶1（V/V） 第Ⅲ相展层溶剂系统（3）：乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=20∶1∶1（V/V） 第Ⅳ相展层溶剂系统（4）：0.05mol·L-1磷酸三钠∶乙醇=3∶1（V/V） 2．混合标准DNS-氨基酸图谱 （1）DNS-氨基酸混合样品，经双向展层后大部分可得到分离，第Ⅰ相用溶剂（1），第Ⅱ相用溶剂（2）。 （2）DNS-天冬氨酸（Asp）和DNS-谷氨酸（Glu）；DNS-丝氨酸（ser）和DNS-苏氨酸（Thr）；DNS-精氨酸（Arg）和DNS-组氨酸（His）；DNS-α-赖氨酸（Lys）和DNS-ε-赖氨酸（Lys）可能分不开；DNS-丙氨酸（Ala）和DNS-NH2也可能重叠在一起。为了分离这些DNS化的氨基酸，可用溶剂（3）在第Ⅱ相再展层一次。 （3）经过3次展层，有时，α组氨酸和精氨酸，α和ε赖氨酸分离还不完全，可用溶剂系统（4）在第Ⅱ相再展层一次。 迁移率 用此法鉴定蛋白质 N-末端氨基酸比 FDNB 法灵敏100倍，仅 10-9～10-10mo1 样品即可检出，产物也比 DNP-氨基酸稳定，且操作简便、快速。 三、实验材料、仪器与试剂 1．器材： 紫外灯，恒温水浴，小型干燥器（或400ml平底烧杯），烧杯，电炉，真空泵，塑料膜，水解管，磨口小试管，毛细管，聚酰胺薄膜。 2．试剂： ①DNS—Cl丙酮溶液：2~5mg DNS-Cl溶在1ml丙酮中，棕色瓶封口，暗处保存，数月稳定。买的商品可能含有一些白色不溶物质（水解产物DNS-OH），这种物质在试剂的保存期间也会慢慢产生。如果水解程度很少，对实验不会有很大影响（不会有很大干扰）。 ②0.2M-1 NaHCO3缓冲液（pH9.5）：用Na2CO3和NaHCO3配制（Na2CO3∶NaHCO3= 3∶7）。 ③5.7mol·L-1 HCl：用优级纯HCl配制。 ④展层液：第Ⅰ相展层溶剂系统（1）：甲酸（88%）∶水=1.5：100（V/V） 第Ⅱ相展层溶剂系统（2）：苯∶冰乙酸=9∶1（V/V） 四、实验操作 1．丹磺酰化技术 胰岛素N-末端氨基酸的DNS 化： 用 0.2M NaHCO3溶液配制 2m M多肽或蛋白质溶液。取0.5ml此溶液加入水解管中，加入0.5ml DNS-Cl丙酮溶液（2.5mg·ml-1），用1M NaOH调pH9~10（用毛细管取样），混匀后用parlfin封口，置37℃保温1h。 DNS-蛋白质的水解： 反应完成后，蒸干丙酮，加 0.2ml 5.7M HCl，喷灯封口，110℃保温16~20h，完成水解。 DNS-氨基酸的抽提： 开管将溶液转移到5ml小烧杯内，将上述水解产物，用1mol/L 盐酸或1M NaOH调至pH2～3。加入0.5mL 乙酸乙酯抽提，分层可在细长滴管中进行。重复抽提2～3 次，将上层抽提液合并于小离心管中，挥去乙酸乙酯，置于干燥器中备用。 用 3滴 丙酮溶解样品、点样展层，即可得到样品的N-末端DNS-氨基酸。 2．以聚酰胺薄层层析鉴定DNS-氨基酸 （1）选择聚酰胺薄膜：聚酰胺薄膜有夹心式（即两面都涂有聚酰胺的板）和单面聚酰胺薄膜，单面的有4×4cm，7×7cm，5×15cm和7×11cm等几种规格。本实验选用4×4cm或7×7cm均可，并要求质地均匀，与尼龙板贴附牢固，无剥脱现象。 （2）点样：将粗细合适的毛细管用沙纸或砂轮将较齐的一头磨平，小心地将样品点在薄膜的右下角，距离边缘 1cm 的地方。样品点要求圆、小，不能把膜触破，最好一次点样成功，即在一处只点一下，因此样品的浓度要合适，如果浓度不够，则需重复在一处多次点样，即在第一次点样后，用吹风机吹干再点第二次、第三次等，在膜上标记。展层第一相样品在右下角，展层后彻底吹干，将膜顺时针转90°， 即样品原点转到左 下角展层第二相。 （3）展层 点样后在小的干燥器里进行展层，首先要在干燥器盖的边缘涂一薄层凡士林，使之密闭不漏气，放入培养皿并调水平。 向培养皿里加入展层剂，溶剂高度不超过 0.6cm，盖上干燥器盖，使溶剂蒸汽在干燥器内达到饱和。 用皮筋或线将点好样的薄膜捆成半圆筒型，并能垂直放稳，皮筋不接触膜，膜在板的内面，即光面在外与皮筋接触。打开干燥器盖，将捆好的薄膜垂直放入盛有展层剂的培养皿里，立即盖好盖，溶剂即向上展层，当溶剂上升到离膜顶端 1cm处时，停止展层，立即开盖标记前沿，取出，彻底吹干后顺时针旋转90°，以同样方法进行第Ⅱ相展层（用第（2）溶剂系统或根据需要可在溶剂系统（3）中展层）。 1、展层10-15分钟，等溶剂前沿到达距膜顶端1.0 cm 时，停止展层 2、铅笔标记