(最强)实验1--大肠杆菌的培养与分离.pptVIP

（1）灼烧灭菌 2、常用灭菌方法： （2）高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min. 高压蒸汽灭菌锅 (3)G6玻璃砂漏斗过滤 …… （2）高压蒸汽灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min. 对于除菌滤器，使用前需高压灭菌，使用后应用HCl进行抽滤，然后放入洗涤液中浸泡48小时，取出用蒸馏水冲洗抽滤烘干保存。 抽滤的装置 121 G6玻璃砂漏斗 1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。 答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。 三、大肠杆菌的培养和分离 培养基的配制 灭菌 超净工作台 倒平板 接种和 培养 分离培养 菌种保存 接种环 取样器 玻璃刮刀（涂布器） 二、大肠杆菌的培养和分离实验步骤 （一）培养基的制备与灭菌 取两个250ml的三角瓶，分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，用牛皮纸包装后放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离 封口膜：既通气又不使菌进入 （二）倒平板 待灭菌后的固体培养基冷却到60℃时，在超净台上分别将培养基倒入4个培养皿中，每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝固后形成平面。 无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 操作时右手无名指和小指夹住封口膜，另外三指持三角瓶，左手拿培养皿并打开上盖的一边，在酒精灯火焰旁操作。 倒平板 步骤一：制备LB培养基(液) 平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 搁置斜面 是试管内的固体培养基经灭菌后，在培养基还没有凝固前（当培养基冷却至60 ℃左右时），将试管口部枕在高约1cm的木条或其他合适高度的物体上，使其自然倾斜，等凝固后在试管内出现的斜面。，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的1/2。 （三）大肠杆菌的接种 将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到灭菌后的LB液体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。 注意事项: 1.在火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌，冷却后方能取菌； 3.接种时右手拿着接种环，右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜； 4.取菌后封口膜和棉塞复原。 三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床上振荡培养12h。 （四）大肠杆菌的扩大培养 （五）大肠杆菌的划线分离 1、操作步骤 （1）灼烧接种环； （2）接种环冷却后，从在摇床上培养了12h的菌液中蘸取菌液； （3）在近火焰处，用带菌液接种环在固体培养基上划线。 灼烧接种环 冷却 划线 （第一区域） 蘸取菌液 灼烧接种环 冷却 划线 （第二区域） 灼烧接种环 冷却 划线 （第三区域） 灼烧接种环 冷却 划线 （第四区域） 灼烧接种环 冷却 划线 （第五区域） 灼烧接种环 平板倒置放置培养 第一区域 第二区域 第三区域 第四区域 第五区域 细菌的分离方法二：涂布分离法 1) 稀释菌液 （10-5 ～ 10-7倍） 用无菌吸管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。…… 2) 涂布 用无菌吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。 3) 培养 将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。 比较：划线分离，方法简单； 　　 涂布分离，单菌落更易分开，但操作复杂些。 划线分离、培养、菌种保存 划线后盖好培养皿，将培养皿倒置 在37 ℃恒温培养箱中培养12-24h 划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 ℃培养24h后，置于4 ℃冰箱中保存。 小结： 培养基灭菌 制作平板 扩大培养 划线分离 菌种保存 将LB液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌 将灭菌后冷却到60℃的LB固体培养基倒入灭菌过的培养皿中，制作平面培养基. 将大肠杆菌从斜面接种到LB液体培养基中，然后在37℃摇床中震荡培养1