生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用.ppt

建议三：样品制备:去除小分子，确保电泳成功 传统透析的瓶颈 特殊预处理，让你饱受煎熬 低回收率，让你暴跳如雷 难于操作，特别是处理小量样品难上加难 由于泄漏导致珍贵样品的丢失比比皆是 长时间透析让你欲罢不能 SnakeSkin?透析袋（15-100ml，无须预处理） Slide-A-Lyzer?微量透析管（ 10-100 ?l ） Slide-A-Lyzer?透析卡（0.1 - 0.5ml,0.5 to 3ml,ml to 12ml,12ml to 30ml） Microdialyzer 微量透析系统 建议四：样品制备：去除盐等不相容物质，确保电泳成功 脱盐 用于蛋白质缓冲液置换 去除核酸溶液中的酚 去除未连接成功的交联剂 标记蛋白时未标记的染料分子等 去除探针标记时的同位素 传统脱盐柱的所有瓶颈 烦琐的重力分部收集 受限的上样样品体积 样品回收率低 回收样品稀释 操作费时费力，无法同时多样品并行处理 新改良的脱盐方法： Zeba?离心式脱盐柱 截留范围 1000 ;样品7000 95%的盐和分子量小于1000的分子储留能力 易于使用，无需平衡和装柱，离心一步收集 无需多步多组分收集，样品几乎没有稀释 快速，少于6分钟 同时多样品并行处理 多种样品体积备选 Zeba?微量离心式脱盐柱： 2 – 12 μl 样品 Zeba?离心式脱盐柱： 30μl－4mL样品 Zeba?96孔离心式脱盐板： 5分钟内并行高通量脱盐， 20 – 100 μl 样品 建议五：样品制备:浓缩样品，增加上样量 Slide-A-Lyzer? 蛋白质浓缩液 原理：亲水的高分子聚合物，将样品中的水和小分子抽吸出来，达到浓缩目的 特点： 精制的高分子聚合物，去除了小分子物质，避免了污染 80分钟内浓缩5－10倍 与透析卡配合使用，效果更佳 Pro#:66530; 66528; 66529 传统浓缩的瓶颈 堵塞离心柱 低回收率 浓缩效果差 长时间倒置离心 iCON?蛋白质浓缩管 30分钟内取得150-400倍的浓缩效果 样品收集简单，且无需倒置离心 大于90%的样品回收率 9K和20K两种截留选择 样品范围从1-7毫升和5-20毫升 适用于平转头和角转头 Pro#:89884-89887 建议六：样品制备：净化与富集同步，确保条带清晰漂亮 PAGEprep?蛋白质净化与富集Kit（Pro：89888） 原理 在DMSO存在下，蛋白质与修饰过的硅藻土胶结合，原缓冲液被离心洗去，上样缓冲液离心洗脱蛋白 特点： 无需透析即可高效去除染料、还原剂，去污剂、糖、甘油、尿素、硫酸铵和胍等与PAGE电泳不相容的杂质 处理小至1ul样品 10分钟内完成,可直接上样电泳 样品浓缩10倍， 20μl的胶可以与20μg以上的蛋白质结合，比常规透析法、超滤法高效，简单、快速 建议七：蛋白质电泳 制胶 Precise? 预制胶 18个月的保质期和12个月的最佳使用期 50 - 60 分钟的跑胶时间 (100 – 110V) 90 分钟转膜时间 (ice, 200mA or 40V) 与大多数电泳槽相容如 上样buffer 电泳条件 染色 Imperial?蛋白质超级染色试剂 Highlights: 即开即用，无须配制 快速简单: 1 hr stain, 1 hr wash 无须甲醇/乙酸脱色 低背景 高灵敏度：－ 3 ng! 与质谱分析或测序相容 第二步：转膜 膜的选择：NC，PVDF，尼龙膜 转膜确认 特殊处理 节省抗体：MiserTM抗体节约缓冲液 增强信号：QentixTM信号增强剂 代替转膜：胶上Western blotting 建议一：转印膜选择 建议二 MemCode? 蛋白质可逆染色试剂 25ng检测灵敏度，是丽春红的10倍 染色不褪色，易于拍照成像 与下游WB检测完全相容，无任何干扰 染色30Sec；脱色10min Prestain ?蛋白质预染Markers 实时监测 分子量参照 灵敏度比较 干扰性比较 建议三：直接在电泳胶上作WB 可以用于转膜困难或者转膜不完全的蛋白质（蛋白质分子量、 PI、缓冲液PH，甲醇，蛋白质疏水性） 无需转膜或封闭 与重新剥离抗体或重新检测相容性好 1ng的检测灵敏度 能用于其它ECL底物 可用于10块迷你胶的检测 Pro#：33500；33505；33510；33515；33550 建议四： MiserTM抗体节约缓冲液 节约抗体可达1/3-1/100 操作简单，仅需10分钟 适用于发光、显色/HRP和AP检测 适用于NC膜 Pro#32110,32105 使用更灵敏的底物 建议五： Qentix信号增强剂 15分钟内使信号强度增强3-10倍； 适用于化学发光，荧光和显色反应