放射示踪及自显影.PPT

(三)亚细胞水平的物质转运研究：为了说明亚细胞结构间的物质转运与细胞机能调控之间的关系，需进行亚细胞水平的物质转运研究。常用电镜ARG动态观察或分离亚细胞组分作放射性动态测量，还可以通过制备亚细胞结构间物质转运模型，即用一定的化学处理破坏细胞膜的特殊转运机制，但不打碎细胞，可以得到上述模型。例如用皂甙处理肝细胞，使其胞膜对胞浆中的成分能自由通透。这样一来细胞内的示踪物量反映颗粒性亚细胞结构中的示踪物含量，故而可以从改变培养液中的影响因素设计中，分析这些因素在细胞调控机制间的相互关系。 细胞动力学(Cell kinetics)是研究生物体内各类细胞的增殖、分化、消亡过程的规律，包括处于各种状态的时间参数、细胞数量、分布位置、细胞迁移途径及更新等。对某些疾病的诊断、治疗及估计预后有重要意义。一、示踪原理 处于S期的细胞因需合成DNA，故可摄取DNA的特异前身物胸腺嘧啶核苷(TdR)合成到新的DNA分子中，由于TdR及其分解产物均为可溶性，而DNA是不溶性的，因此，可通过一定的方法将它们与DNA分子分开。当将放射性核素标记的TdR引入待研究的实验体系后，放射性就会出现在被标记的细胞中。在细胞动力学研究中最多用的标记化合物为3H-TdR(或14C-TdR)，可采用离体或整体实验，由于体内实验存在射线辐射的影响，使用受到一定限制。放射自显影是最常用的方法之一 二、示踪的具体方法 细胞动力学的示踪研究最主要的是对细胞进行标记。根据对细胞的标记时间、次数以及标记后的采样情况可将放射性核素标记法分为： (一)一次脉冲标记法：根据取材方法不同可分为一次取材和多次取材两种研究方法。 1.一次取材：采用的标记时间较DNA合成期短，将3H-TdR加入含异步细胞群体的培养体系中培养15～60分钟，以不含放射性的培养液洗涤数次，将样本作放射自显影，计数标记细胞并按下式计算标记指数(Labelling Index)： LI=Ns/Nc…… (6—5) Ns这标记细胞数，Nc为处于细胞周期中的总细胞数。 2.多次取材：进行一次脉冲标记后，在一定时间内多次取材，用自显影方法观察处于有丝分裂期的细胞(M细胞)中有3H标记的细胞的百分数，简称标记有丝分裂百分率(PLM)。 PLM=（标记有丝分裂细胞数）/（有丝分裂细胞总数）×100% 以PLM为纵坐标，标记后时间为横坐标，可得PLM曲线 当标记结束，原S期的细胞全部被标记，这些细胞进入M期后，即出现标记M期细胞，期间要经过G2期，由于开始一段时间内PLM等于零，故G2期为从标记开始至出现标记M期细胞的时间间隔。随着标记时间的延长，标记的S期细胞陆续进入M期，PLM逐渐上升并达到最高值(≈100%)，此间隔即为TM期。当标记的S期细胞全部进入M期，而标记时处于G1期的非标记细胞亦开始进入M期时，PLM开始下降，这标志着所有的原S期细胞均通过M期，此间隔即为Ts期。随后PLM逐渐下降至零，直到S期细胞再次进入M期，PLM从零又逐渐上升。一个细胞周期时间即指PLM两次由零上升之间的间隔时间，因此， TG1=Tc-(TG2+Ts+TM)…… (6—8) 实测的PLM曲线有时第二峰不能达到100%，计算细胞各参数时常采用曲线上50%的截点。因此，TG2期为从标记开始到标记M期细胞达50%的时间，实际上是TG2+TM/2，因TM为较短的时相，误差较小。Ts为曲线第一个波峰的两个50%之间的间隔；TC为第一个波峰和第二个波峰上升至50%两点间的时间；第一峰下降段的50%点与第二峰上升段的50%点间的时间间隔为TG1+TG2。此法不能求出TM，但若能精确测出TG2，可由TG2+TM/2计算TM。 TG1+TG2 Ts TC TG2+TM/2 TG2 PLM法的局限性为不适用有丝分裂指数低的细胞组织，此外实验时需多次取材，工作量比较大。除PLM法外，也可采用银粒计数减半法(grain count halving method)研究细胞动力学。方法是：将3H-TdR脉冲标记后，在不同的时间间隔内多次取材制备自显影标本，计数标记核上的平均银粒数，平均银粒降低到原计数的一半所需的时间即为细胞周期时间。以本法进行细胞动力研究时要求细胞群体具有一定的同步化程度，故其应用受到较大限制。 (二)二次脉冲标记法：对待测细胞群体用不同核素(如3H-TdR和14C-TdR)或同种核素但浓度不同进行两次标记，每次标记时间为15分钟，两次标记间隔要小于TG2(通常为1小时)。以前者较常用，也采用自显影方法观察，由于3H、14C的β-粒子能量不同，因此，细胞同时有3H-TdR和14C-TdR参入后形成的感光颗粒分布位置也不同，前者主要分布在细胞核上，后者由于其身线能量较强，则分布在胞浆及胞核中。 如