采油微生物筛选、鼠李糖脂产脂性能及关键酶基因克隆与表达研究.doc

采油微生物筛选、鼠李糖脂产脂性能及关键酶基因克隆与表达研究 山东大学博士学位论文 采油微生物筛选、鼠李糖脂产脂性能及关键酶基因克隆 与表达研究 摘 要 世界范围内原油贮量的日益减少带来了严重的能源危机,而以常规技术,一 般只能开采出%的原油,大量石油尤其是高粘油滞留在储油层。微生物提高原 油采收率是目前公认的开采油藏中剩余油和枯竭油藏最好的技术,对 充分利用现有油矿藏资源,意义重大。另外,在石油的勘探与开采,运输与储存, 炼制与使用过程中,常会造成石油外泄或不当排放,对环境造成严重的污染。应 用烃降解微生物对污染地区进行生物修复因其具有适用范围广、操作简单、效果 显著、费用低、无二次污染等优点而被认为是解决复杂烃类污染的最彻底最有效 的手段。 铜绿假单胞菌所产生的鼠李糖脂生物表面活性剂具有良好的表/界面活性和 乳化活性,能形成胶束溶液,乳化分散烃类物质,降低原油粘度;对烃类的增溶 作用能促进微生物对烃类的摄取,从而提高微生物对烃类的降解效率;此外,作 为生物表面活性剂又具有无毒、可生物降解的优点。这都使其成为在和 石油污染的生物修复领域中最佳的生物表面活性剂。 不同来源的铜绿假单胞菌其鼠李糖脂的组成,性能,产量差距均较大,寻找 合适石油工业的产脂菌株及其复配菌株具有重要价值。另外,铜绿假单胞菌虽然 可高效产脂,但它是人体条件致病茵,不适合大规模工业应用。而利用基因工程 的方法,将鼠李糖脂合成途径中的关键酶??鼠李糖基转移酶转入其它无害采油 微生物受体中,构建产鼠李糖脂的工程采油微生物直接应用于生产可以有效避免 菌株毒性。关于鼠李糖基转移酶基因在采油菌中的表达研究,少见国内外报道。 在此方面的研究可为基因工程菌在微生物采油和石油烃污染的生物修复中的应 用提供理论基础。 本文主要从上述两点展开进行研究工作,主要研究内容和结果如下:山东大学博士学位论文 .产鼠李糖脂的原油降解菌的筛选与鉴定 以原油为唯一碳源和能源,从油田样品中分离筛选多株兼性厌氧原油烃类 降解菌,通过表面张力测量从中筛选出产糖脂生物表面活性剂的原油降解菌 。通过形态学观察、生理生化实验和 序列分析鉴定其为铜绿假单 胞菌 。该菌生长于原油培养基中,能很好的乳化分 散原油,并将原油发酵液的表面张力降至. /。经.分析,. 可以利用较宽范围的原油烃组分,其原油降解率为 .%,原油粘度降低率为.%。利用、及蓝平板法分析,证明其产生 的生物表面活性代谢产物为鼠李糖脂。 .鼠李糖脂理化性质和乳化活性的研究 所产的鼠李糖脂粗提样品。利用.分离鉴定 制备. 了其所产鼠李糖脂同系物中的组分。结果表明,以甘油为唯一碳源时,尸. 所产鼠李糖脂中主要包含种同系物,都由分子鼠李糖和 个℃碳链长度的.羟基饱合或不饱合脂肪酸组成。该鼠李糖脂粗品 为. 。该糖脂表现极高温度 /,在时的表面张力为. .℃和盐度耐受性小于%,%和及优良的环 境稳定性,并可在一定的范围内~保持活性。对液体石蜡、甲苯、植 物油和原油等疏水性有机物具有良好的乳化性能。这些性质使得其在石油工业和 石油污染修复领域具有良好的应用前景。 .碳氮源对鼠李糖脂生产的影响 产脂的影响进行了研究。结 就不同种类的碳源和氮源对. 果表明,. 可以利用多种类型的碳氮源产脂。其中以葡萄糖与菜 籽油:为复合碳源,酵母粉与硝酸钠为复合氮源,且碳氮比为:时产脂 量最高,达. /。保持此最优碳氮比加大碳氮源浓度时,在碳源浓度为% 时产脂量最高,达. /。这些研究为进一步的鼠李糖脂发酵生产条件的优化 和应用不同碳氮源时所产鼠李糖脂组分与理化性质的研究提供了依据和基础。 Ⅱ山东大学博士学位论文 .鼠李糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达研究 的鼠李糖基转移酶结构基因和操纵子进 对. 行克隆与鉴定。构建含鼠李糖基转移酶和的重组质粒和 、 ,利用鼠李糖基转移酶自身启动子使其在大肠杆菌. 中进行表达。结果表明,只转入结构基因的两种大肠杆菌产脂量均 很低;而转入操纵子的两宿主产脂量均有所提高,其中 产 脂量最高达. /。仅管是应用自身启动子而不是强启动子进行表达,这一 产量在重组大肠杆菌表达鼠李糖脂的研究中仍是较高的,并且可以避免使用 带来的成本问题和操作上的麻烦。对鼠李糖基转移酶基因进行克隆及在大 肠杆菌中表达,为该基因在采油菌中的表达研究提供基础。 .鼠李糖基转移酶基因在采油微生物中的表达研究 构建了采油微生物接合转移系统,利用该系统成功地将含鼠李糖基转移酶 和的重组质粒和转移进入采油微生物受体菌中 并进行了验证。鼠李糖基转移酶基因在采油微生物中的表达情况与其在大肠杆菌 中的表达情况基本一致。只转入结构基因的两种采油菌产脂量极低;而转 入操纵子的两宿主产脂量均有不同程度提高,其中 . 产脂量最高为./。这