mRNA 差异显示技术研究综述.docVIP

PAGE PAGE 1 mRNA差异显示技术研究综述 　　摘要：分析一对细胞或组织在不同状态下基因表达的差异，已成为分子生物学研究领域的热点之一，用于识别差异表达基因的方法有多种，DDRT-PCR是近年来较为广泛应用的一种技术。DDRT-PCR技术有很多优点，但同时也存在不少问题，通过对其进行不断地改进使这项技术在分子生物学中能更好更广地应用。 　　关键词：mRNA；差异显示；PCR 　　中图分类号：Q343文献标识码：B文章编号：1007-273X（2013）04-0068-03 　　高等生物的细胞中约有1.5万个基因处于表达状态，但只有15%的基因得以表达。基因的差异表达不仅是细胞形态和功能多样性的根本原因，同时也是各种生理及病变过程的物质基础。比较不同细胞间或同一细胞不同时间与空间基因表达的差异，分析与病理变化相关的特异性表达基因，对生物学及相关学科的研究有重要意义[1]。 　　20世纪90年代初，Bauer等[2]在AP-PCR和RT-PCR技术的基础上建立了mRNA差异显示或称差异显示逆转录PCR（DifferentialDisplayreversetranscriptionPCR，DDRT-PCR），是一种有效的筛选差异表达基因的方法。1994年ErricHaay等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT-PCR）。与研究DNA差异相比，研究mRNA的差异排除了非编码区的影响，使研究范围缩小到表达基因水平上，为人类进一步了解生命过程提供了一个工具。 　　1mRNA差异显示技术的原理及技术路线 　　mRNA差异显示技术是在转录水平上对基因表达进行分析的。成熟的mRNA的3′端具有poly（A）尾巴，以一系列Olige（dT）12MN引物中的一种（M、N分别代表A、C、T、G四种碱基中的一种，M不能为T）锚定于两种或两种以上一条mRNA，再于变性PAGE胶上分离目的片段，并就基因表达的差异对比材料的mRNA的poly（A）尾部。在反转录酶的作用下，逆转录真核细胞中全部表达的mRNA，可获得1/12cDNA，同时5′端设计一组随机引物，通过PCR扩增，进行比较。将有差异的基因片段从凝胶上切割下来，用相同的锚定引物和随机引物对分离的片段进行二次扩增，得到差异片段后将该片段克隆、测序，并同基因库的序列进行同源性比较或者将差异显示的DNA克隆测序后作为探针，进行斑点杂交和Northern印迹确保是否是真阳性结果，以进一步分析其功能。 　　2实验材料的选择 　　在细胞或组织选择方面应尽可能使相互比较的样本在基因型上一致或比较接近，以减少非相关带的检测。对于培养的细胞而言，互相比较的细胞应在相同的培养基中培养。高质量的RNA是DDRT-PCR技术成功的关键因素之一。另外，在进行DDRT-PCR实验时，所有的PCR反应最好都应用同一来源的TaqDNA聚合酶，因为不同来源的TaqDNA聚合酶的贮存缓冲液及其在贮存和反应温度下的活力可能会存在差异，从而可能会导致DNA带型的差异。 　　3mRNA差异显示技术的优点及缺陷 　　DDRT-PCR技术通过对一系列引物的组合利用，能够在较短的时间内获得差异显示基因，该方法具有很多优点，如敏感（可鉴定低丰度的mRNA）、快速、易操作等。然而在实际操作中仍存在一些问题，主要表现为假阳性率高、对高丰度mRNA具有明显的倾向性[3]、易引起污染（因为起初的mRNA差异显示技术是通过同位素进行放射自显影显示差异条带的图像的），此外由于某些序列的特异性，一些差异表达的转录不能得到分离[4]，所以凝胶中的单条带可能由1种以cDNA片段所构成。 　　4mRNA差异显示技术的改进 　　针对mRNA差异显示技术存在的问题，人们想到很多新方法来完善这项技术。 　　4.1引物的改进 　　最初的锚定引物为OligodT12MN（M=A/C/G；N=A/T/C/G），共12种组合，其工作量很大。Liang等[5]将锚定引物先后改为4种兼并引物（T12MA、T12MT、T12MC、T12MG。M=A/C/G）和单碱基锚定引物T11M（M=A/C/G），减少了工作量，增加了重复性，也提高了分辨率。又将cDNA分组的数量减少到3个[6]，并证明使用3个单碱基锚定Oligo（dT）引物可以解决与使用双核苷酸丰余引物相关的大部分问题。随后也有人用较长的引物，使问题得到进一步改善[7]。 　　4.2PCR的改进 　　Marten等建议两步PCR法，即开始的4个循环为低严谨性，后面则采用高严谨的PCR循环，他将此技术称为EDD（Enhanceddiffferentialdisplay）。推荐的PCR参数为：开始3个低严谨循环：第一个循环，94℃变性5min，40℃退火5min，68℃延伸5min；接着两个循环：