高效液相色谱分离法.pptVIP

柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 有人形容，柱是HPLC的心脏，可见在HPLC工作中选择柱的重要性。因为用不同的柱，因其分离机理也不同，得到的效果也不同。通常有：反相HPLC，疏水HPLC，凝胶过滤HPLC，各种离子交换HPLC，亲和HPLC等等。 对色谱工作者来讲，柱效是不离口的。新柱到货后，厂方都应有检查柱效的结果报告附上。用户可以据此检查验收，但由于试剂、水质、仪器型号等方面的差异和运输过程的影响，按常规，柱效允许有10％的差别。 　　 柱的分辨力和柱效的测定，一般采用几种化合物为标淮，在特定的条件下进行分离，并据此结果计算柱效。 以Beckman公司的反相柱为例，采用一些小分子化合物，配置如下：Acetophenone (苯乙酮）33mg，Nitrobenzene（硝基苯） 59mg，Benzene（苯） 2g，To1uene （甲苯）3g，溶于3L甲醇中备用,进样5ul，254nm检测。 在鉴定Phenyl 5PW柱时用丙酮为标准品，水作流动相;在鉴定CAA-HIC柱时用α- 胰蛋白酶原为标准品(5mg／m1，进样5u1)，3.0M (NH4)2SO4 ,0.5M NH4Ac(pH 6.0)和0.5M NH4Ac (pH 6.0)，20min内线性梯度洗脱； 在鉴定DEAE-和CM-柱时，分别用Uric acid(0.1mg／m1)和Tryptamine(0.1mg／ml作标准品； 在鉴定G2000SW 或G3000SW时分别用Dextran (MW 500000)，PEG(MW 7500)和PEG(MW 3000)或已知分子量的蛋白质为标准。 此外还有Cyano-，IP-，Si-等柱，都可在厂商的资料中查阅到有关信息。 以应用生命系统(applied biosystems)的微柱为代表，直接采用一些标准蛋白质来鉴定反相柱、离子交换拄、疏水柱的分离效 果，这对生物化学工作者来讲，更加直观。 这5种蛋白质依次是：细胞色素C、胰岛素、乳白蛋白、碳酸酐酶、卵白蛋白。有时也用核糖核酸酶，溶菌酶，胰凝乳蛋白酶原等。Β-乳球蛋白的胰蛋白酶酶解液(多肽)也用作鉴定柱效。 1． 微柱(narrow column microcolumn) 经典的柱是250mm×4.6mm I.D, 离子交换柱是75mm×7.5mm I.D, 而微柱内径是1~2mm，长度有30，100，150等等。 微柱的优点是： 分辨力至少和经典柱一样，长些的柱效果更好。 回收率高。因为柱的载体少，非专一性吸附少。 灵敏度高。由于流速仅50~200ul／分钟(经典柱1m1／分钟)，样品的峰尖窄,所以检出灵敏度增加。 溶剂消耗少，节省运转费用：以流速100ul／min，一个流程1小时计算，分析一个样品只需6m1洗脱液．约仅消耗3m1乙腈。 这种载体颗粒度约3~5um，表面无孔径，因此被分析的物质不会进入载体内部，而只在载体表面进行吸附、疏水结合或交换等，故可用于蛋白质和多肽的快速分析，一般流速1.5m1／min．只需几分钟即可完成。当应用经典的柱分离生物大分子时，通常使用较慢的流速，因为大分子进出柱介质孔径结构的速度较馒，如果为缩短时间而采用较快的流速，则分辨率下降。无孔径载体柱的发展克服了因蛋白质大分子进入载体颗粒内部而引起的局限性，解决了高流速时样品峰太宽及拖尾等问题。 它的载体颗粒结构中含有两类孔径，大的孔径有6000~8000A孔径，它比常规的HPLC柱载体的分离速度快10倍，而不降低分辨力, 是大量制备蛋白质类产品很有潜力的方法。 从1986年发展了微柱HPLC分离蛋白质和多肽，将HPLC流动相流速从经典柱(250mm×4.6mm I.D)的1mL/ min降低到50u1/ min (用两个10 m1的注射泵产生梯度，这类泵的优点是没有脉冲，产生的梯度平稳)，1995年K.Yamada发展了毛细管HPLC，用2.5m1的注射泵，流速仅5u1/min，样品上样量5~25u1；柱为150 mm×0.5mm I.D；梯度时变化小于10 n1/min。 收集系统改为毛细管直接点涂在PVDF膜上，