2012外源基因表达与基因工程药物.ppt

第十章 外源基因表达与 基因工程药物 胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体 基因表达 指基因通过转录和翻译而产生其蛋白产物，或转录后直接产生其RNA产物的过程。 学习要求 掌握：基因表达的基本原理，外源基因表达的基本过程。 熟悉：外源基因表达的基本类型，外源基因表达载体的基本组成与功能。 了解：外源基因表达在生产基因工程药物中的应用。 外源基因表达基本类型 根据宿主细胞不同：原核细胞表达系统；真核细胞表达系统。 根据表达产物在宿主细胞生成的部位不同：胞内表达、定位表达、分泌表达。 根据表达产物的溶解状况不同：可溶性表达、包涵体表达。 根据表达产物的结构状况不同：非融合表达；融合表达。 基因工程的重大意义1) 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。 跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、植物和动物，造福人类，在过去人们难以置信的事情，现在已成为现实。 （2）利用重组DNA技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域。 （3）医学上应用更为广泛，涉及各领域正常人类生命活动的分子机制；人类各种疾病发生的分子机理；人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、心血管疾病、传染病等病因的 查明、诊断、治疗和预防。药物的研发和生产；疾病模型的建立；人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康） 分子遗传学理论上的六大进展解决了 生命现象的遗传物质基础（均是核酸） 结构模型（同类构件、双螺旋） 复制方式（相似的机制） 遗传信息流动方向（共同的中心法则） 遗传密码（共用一套相同的密码） 表达和调控的机理（类同的方法） 基因突变机理、意义（变异与进化） 为基因工程技术的诞生典定了理论基础。 理论上的可行性。 二、分子遗传学新方法是 基因工程的技术基础 首当其冲的是要解决： ① 如何自如地得到目的基因； ② 如何在体外改造基因，得到重 组体； ③ 在体外转移重组基因； 直到20世纪70年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。 基因操作的工具 一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶 限制酶（Ⅱ型） 特异识别及切割4?8个bp长度且具有回文序列的DNA片断 回文序列：是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称; 限制性核酸内切酶 命名： 大肠杆菌：Escherichia coli；EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)；流感嗜血菌：Haemophilus influenzae; HindIII 限制酶切出的末端 粘性末端（sticky end）:两条链上的断裂位置是交错的、但又是围绕着一个轴线对称排列，其结果产生两个互补的单链末端，这种单链末端由于可以互补成双链结构，所以称为粘性末端。 平末端（blunt end）: 在识别序列内同一位置上的核苷酸处进行切割，产生的DNA片段不带粘性末端而是没有单链突出的平齐末端。 大多数的DNA片段不具备自我复制能力，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，就必须将DNA片段连接到一种具有自我复制能力的DNA分子上，这种DNA 分子就是载体。 载 体（Vector） 载体(vector)是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具，其化学本质为DNA 。 常用的载体分为3类：质粒、噬菌体和病毒  大肠杆菌的质粒载体 宿主（host） 能接纳重组子并实现重组子的外源基因转录、扩增或表达的受体细胞。 原核细胞：大肠埃希菌、芽胞杆菌等。属于原核细胞表达系统。 真核细胞：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。属于真核细胞表达系统。 基因工程的主要步骤 1. 从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因的DNA片段------目的基因的获得。 2. 将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子