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免疫组化技术IHCImmunohistochemistry 讲解人：王万林 学号：2017021497 免疫组化技术( IHC) 免疫组织化学技术，又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，利用抗原－抗体特异性结合的原理通过化学反应使标记抗体的显色剂显色以确定细胞内抗原，以此对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行定位、定性及定量的研究。 发展简史 1.——1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 2.—— 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。 3.—— 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细 胞化学得到广泛应用。 4. —— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜 技术相继问世。 5.—— 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。 6.——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的 一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。 原理 免疫组化正是利用抗体和抗原特异性结合特性，先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，再借助组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。 WB IHC对比 分类 （1）根据染色方式分成：① 贴片染色② 漂浮染色 （2）根据Ag—Ab（抗体-抗原）结合方式分成： ① 直接法② 间接法③ 多层法 （3）按标记物的性质分成： ① 免疫荧光技术（免疫荧光法）是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。 ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAP法、 ABC法）免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。 ③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法）免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。 样品处理 组织样本 石蜡切片 冷冻切片 细胞样品 细胞块石蜡切片 细胞爬片 细胞涂片 组织切片分类 IHC-P：石蜡包埋细胞团和组织 免疫染色前，需收集细胞团样品并将其固定于 10% 的中性缓冲福尔马林 (NBF) 中，以维持细胞形态和抗原表位。将浸润石蜡的样品置于装有少量液态石蜡的模子中，将其冷却。切片获取样品，并将其置于有助于样品粘附的带正电荷的载玻片上。 IHC-F：冷冻组织 切片前，应将冷冻组织储存于 –80 ℃的温度下，然后包埋入包埋剂。准备染色时，切片前将组织置于 –20 ℃环境中 平衡组织成分。切片获取组织，并将其置于带正电荷的载玻片上。 石蜡切片 冷冻切片 石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 免疫组化IHC-P染色步骤 免疫组化各步骤及注意事项 注意：石蜡包埋的组织样本一旦完成切片，要尽快进行染色 如果过早切片，让切片暴露在室温太久，容易造成组织细胞抗原性受损 应尽可能在切片后两周内进行染色。蜡块及切片的保存最好在4℃保存。 注意：脱蜡前，对玻片进行烘烤，56℃ 2-3h，可以彻底除去水分，并升高玻片温度，帮助石蜡溶解， 复水后的所有步骤，切片都要处在水环境中，防止干片。 IHC临床应用与实例 主要包括以下几方面： ⑴恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断； ⑵确定转移性恶性肿瘤的原发部位； ⑶对某类肿瘤进行进一步的病理分型； ⑷软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的； ⑸发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。 ⑹为临床提供治疗方案的选择