基因工程的基本操作程序35892.ppt

2．退火 引物与模板互补成双链。 （55～60℃） (由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。) PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸 引物 PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸 3．延伸 在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。70～75℃ 延伸 变性 第二次循环 退火 第二次循环 延伸 第二次循环 ㈡ PCR反应曲线 理论上，PCR反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增25-30个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 PCR仪程序设定 PCR的应用 PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。 实例 1： 1、下列获取目的基因的方法中需要模板链是（ ） A.从基因文库中获取目的基因 B.利用PCR技术扩增目的基因 C.反转录法 D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 （二）基因表达载体的构建—形成重组DNA分子 切割目的基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗？ 同一种 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用。 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。 常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、 土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞等 ㈣ 将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 导入方式： （三）将重组DNA分子导入受体细胞 导入微生物细胞 将目的基因克隆到大肠 杆菌细胞中的操作步骤： 1)获得目的基因和质粒载体； 2)形成重组质粒； 3)制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞； 4)培养大肠杆菌，让重组质粒形成大量拷贝； 5)筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞。 导入植物细胞：土壤农杆菌转化法 土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染双子叶植物和裸子植物 基 因 枪 法：单子叶植物常用的一种基因转化方法，但成本较高。 花粉管通道法：十分简便经济的方法。我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得。 将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序： 重组DNA提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵发育 新性状动物 转基因动物 1.筛选含有目的基因的受体细胞 通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。 （1）抗药性筛选法： 菌株为某种抗生素缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如抗氨苄青霉素，抗卡拉霉素等）。如何筛选出含有目的基因的受体细胞？ （这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。） （四）目的基因的检测与鉴定 pBR322质粒结构 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 标记基因 进行筛选 限制性内切酶 识别序列 外源基因连接 PStⅠ PStⅠ 自主复制 （2） DNA分子杂交——检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ①首先取出转基因生物的基因组DNA ②用含目的基因的DNA片段（单链）用放射性同位素等作标记,以此做探针 ③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中 过程: 利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆 检测方法： DNA分子杂交技术 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 2.检测目的基因的表达 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 目的基因成功表达的标志——体现特定性状 检测性状 （3）鉴定（个体生物学水平）： （1）检测目的基因是否转录出了mRNA （2）检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 ①方法: 分 子 杂 交 方法: 抗原—抗体杂交 ②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA 回答问题： 1、基因工程的别名： 2、操作环境： 3、操作对象： 4、操作水平： 5、基本过程： 6、结果： 基因拼接技术或重组DNA技术 生物体外 基因 DNA分子水平 人类需要的基因产物或新的性状 思考： β—珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β—珠蛋白，想一想，