精品植物生理学实验技术植物转基因技术植物学课件药用.docxVIP

实验一、植物基因表达载体设计与构建)培养基配置及灭菌、倒板(LB 液体，三角瓶若干，各种颜色枪头每组一套，，表达载体设计原理，引物设计原理 ,配质粒提取所用试剂并选择需要的灭菌(公用溶液I, 50XTAE, III,,目的基因的酶切，电泳检测2XCTAB)介绍实验室的规章制度、注意事项： 注意用水用电安全2?灭菌锅及酒精灯的安全使用3?规范实验操作准备实验 ：1.分组，分发实验服、试验用具2.讲解注意点：有毒试剂戴手套操作3. 准备枪头：装盒，灭菌4?各个型号的EP管的灭菌5?双蒸水灭菌6. 洗净培养皿、摇菌小三角瓶、试剂瓶等实验目的：1?运用基因工程操作原理，学 会植物表达载体的设计、构建、筛选及检测；2. 了解并掌握构建植物表达载体的 必备元件；3.学习引物的设计原理4?学习和掌握酶切和琼脂糖电泳技术5?学 习并掌握灭菌锅的使用实验原理：获取目的基因：(1)从基因文库中获取目的基 因(2)人工合成法(3)利用PCR技术扩增目的基因：PCR 是聚合酶链式反应的缩写。这项技术是由穆里斯等人于1988 年发明的，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。PCR 是一项在牛物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。植物表达载体的构建： 基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心。1. 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并口可以遗传给下一代；使目的基因能 够表达和发挥作用。2.表达载体的组成：目的基因启动子终止子标记基因等。 启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录产牛mRNA。 终止子：位于基因的尾端，终止DNA 的转录。它就相当于一盏红色信号灯，使转录在需要的地方停下来。 标记基因：它的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的 基因的细胞筛选出來，如抗生素基因就可以作为这种基因。基因表达载体模式图 3、构建步骤①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。 用同种限制酶切割目的基因，产生相同的黏性末端。 将切下的目的基因片段，插入质粒的切口处，再加入适量的DNA 连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。 不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会 有所差别。将目的基因导入植物细胞I、农杆菌转化法II、基因枪法(乂称微弹轰 击法):是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。III、花粉管通 道法实验步骤：1.配制LB液体培养基：1 ?称量下列试剂，置于1L烧杯中 Tryptone 10g Yeast Extract 5g NaCllOg 2.加水补至 IL。3. 高温高压灭菌后，4°C保存。2.配制电泳缓冲液TAE缓冲液50xTAE242gTris57」 ml 冰乙酸 18.622g EDTA (100ml 的 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0))加水补足 1 L3? 配制1质粒雄取试验所需试剂：以下试剂每种配制100ml 1 solutionl： (1L) 50mM Glucose 9g 25mMTris.CI pHO 取lMTris.Cl 25ml lOmM EDTA pH8.0 取0.5M EDTA 20 ml 灭菌 15min, 4。(2 保存 2、solution II： (lml) lOMNaOH 20pl 10SDS lOOgl ddH2O 定容至 111]137弋溶解至清后使用 3、solutionlll： (100ml) 5MKAc 60ml 冰乙酸 11.5ml ddH20 25ml 10SDS： (500ml) SDS 50g 加ddH2O 400ml 68。(2溶解后定容500ml 5MKAc： (100ml) KAc 49.07g 68。(2溶解后定容至 100ml 0.5M EDTA pH8.0： (100ml) EDTA.Na2 18.61g 加80mlddH2O溶解 NaOH 调pHO,定容至 100ml,高压灭菌 1 MTris.Cl： (100ml) Tris 12.1gddH2O 80ml溶解HC1调pH,用量约为：pH8.0: 4.2mlo定容至100ml,高压灭菌。目的基因的酶切：配20L 体系：Enzyme 1: lLEnzyme2： ILBuffer： 2LTemplate： XLddH2O:补齐至 20L37°C水浴2h琼脂糖凝胶电泳：制备1琼脂糖凝胶倒板，电泳检测酶切结果。 实验二、碱裂解法小量制备质粒，电泳检测准备工作：前一天下午3 点挑菌，准备阳性大肠杆菌Gus 的甘油管实验目的：通过本实验，掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和相关基本技 术。实验原理：碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA 的方法，其基本原理