《植物组织培养与快繁技术》第3章(PPT-74).pptVIP

§1 植物组织培养的基本设施 §2 植物组织培养的基本技术§3 植物组织培养的一般步骤 §1 植物组织培养的基本设施一、 组织培养实验室的设置 培养基制备室：用于植物组织培养所需器具的洗涤、干燥和保存、培养基的配制、分装和灭菌、化学试剂的存放与配制、蒸馏水的制备和植物材料的预处理等操作， 无菌操作室：无菌操作室也叫接种室，它是进行植物材料的消毒和接种、无菌材料的继代转移等无菌工作的场所 培养室：用作培养材料的培养和观察，要求能控温、又能通风，并有相应的培养架和照明设备。 温室、大棚：用于组培苗的炼苗、移栽等 其它：细胞学实验室、生化分析室等 二、组织培养实验室的主要仪器设备 常规设备 ：冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计、加温设备等 灭菌设备：高压灭菌锅、干燥箱、酒精灯、过滤灭菌器 无菌操作设备：超净工作台、接种箱灯 培养设备：培养架 、光照培养箱、恒温摇床 、转床等 其它设备：显微镜、离心机 三、组织培养实验室常用的器皿用具 培养用器皿：培养瓶、三角瓶、试管、L型管和T型管 、培养皿等 操作器皿：试剂瓶、容量瓶、量筒、移液管、烧杯，量杯等 操作工具：镊子、剪刀、解剖刀、接种工具 §2 植物组织培养的基本技术 一、 洗涤技术：玻璃器皿洗涤、塑料器皿洗涤 二、 灭菌技术（培养基、培养用具灭菌）：湿热灭菌、干热灭菌、过滤灭菌、化学灭菌、辐射灭菌等。 三、 无菌操作技术：无菌室的消毒、材料的消毒、接种等 一、 洗涤技术 新购置的玻璃器皿带有碱性物质，应先用1%稀盐酸浸泡，再用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，烘干备用。已经用过的培养器皿，先将培养基除去（如果被菌类污染，则需经121℃高压蒸汽灭菌后再处理），用洗涤溶液浸泡并刷洗干净，清水冲洗，蒸馏水冲洗后，烘干备用 2. 塑料器皿一般用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。必要时可以用10-3mol/L EDTA溶液洗涤，以除去污染的金属离子，最后用蒸馏水充分漂洗，倒置晾干备用。 5. 金属器皿 新购置金属器皿因其上有润滑油或防绣油，用蘸有四氯化碳（CCl4　）布擦去油脂，再用湿布擦净，干燥备用。 3. 对吸管，滴管等不宜刷洗的玻璃器皿，先用去污粉和去油剂刷洗，自来水冲干净后，晾干，再浸入硫酸－重铬酸钾洗液中浸泡若干小时，用夹子取出在自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1－3遍，稍晾不滴水后置于干燥箱内烘干备用。 4. 对带有凡士林，石蜡，或胶布的器皿选用特殊方法处理后，再用常规方法洗涤。 5. 金属器皿 新购置金属器皿因其上有润滑油或防绣油，用蘸有四氯化碳（CCl4　）布擦去油脂，再用湿布擦净，干燥备用。 二、 灭菌技术 1.　湿热灭菌 培养器皿灭菌：将洗净的培养器皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，于压力为1.1kg/cm2(121℃) 下灭菌20－30min。 培养基灭菌：将分装好的培养基封口后，置于高压灭菌锅中1.1kg/cm2(121℃) 灭菌15min。 干热灭菌法 洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中，150℃40分钟或120℃两小时，待冷却后使用。 三、无菌操作技术 无菌室灭菌（接种室、培养室） 用新洁尔灭擦抺工作台，70%酒精擦拭超净工作台。 接种前用70－75%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。 用紫外光灯进行照射灭菌（波长2650－2660A最好）30－40分钟。 之后开风机15分钟 用75%酒精洗工作台面 定期对接种室及培养室薰蒸 方法：密封房间，甲醛倒入蒸发皿加热或加入5g高锰酸钾（KMn4） ，用量6-8ml/m3甲醛。 接种 接种的关键技术： 防止污染 防止空气污染 防止操作带来的污染 防止器皿用具污染 分布均匀 注意不同外植体接种方法 防止空气污染 接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中 防止操作带来的污染 A、整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速 B、接种过程中尽可能达到悬空要求 C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口 D、瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口 防止器皿用具污染 接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生 分布均匀 外植体必须与培养基紧密接触，且在培养容器内均匀分布，以保证营养的充分利用，以及光照条件均匀一致 四、培养基及其制备技术 1 、培养基的成分： 无机元素（无机盐）： 无机元素在植物的生长发育中扮演着非常重要的角色：氮是各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成部分，钙是细胞壁及细胞内信号传导途径中的重要组合；而铁、钼、锌等则是植物体内某些酶的重要组成部分。除C、